อิเล็กโทรโฟรีซิสเจลแนวนอนสําหรับ DNA พลาสมิด: การแยกรูปแบบ Supercoiled, Nicked และ Linear

ดีเอ็นเออิเล็กโทรโฟรีซิสเป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในอณูชีววิทยา หนึ่งในแอปพลิเคชั่นที่ต้องการการแยกในระดับสูงสุดคือการกําหนดรูปแบบโทโพโลยีหลักสามรูปแบบของดีเอ็นเอพลาสมิด ได้แก่ supercoiled, nicked (open circular) และรูปแบบเชิงเส้น เราจะแสดงให้เห็นว่าระบบเจลแนวนอน HE-50 ใหม่นําเสนอการแยกพลาสมิดและการควบคุมคุณภาพที่ช่วยให้สามารถแยกและทําซ้ําได้มากขึ้นได้อย่างไร

[ข้อควรพิจารณาห้าประการสําหรับกระบวนการอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลกรดนิวคลีอิก Thermo Fisher Scientific - สหรัฐอเมริกา]

โทโพโลยีพลาสมิด: สามรูปแบบ

พลาสมิด DNA ไม่สม่ําเสมอและเป็นส่วนผสมของไอโซฟอร์มโทโพโลยีสามแบบ ในบริบทของการแยกรูปแบบเหล่านี้จะให้อัตราการย้ายถิ่นที่แตกต่างกันระหว่างอิเล็กโทรโฟรีซิสของดีเอ็นเอ

•รูปแบบ Supercoiled (SC): พลาสมิด Supercoiled ถือเป็นสายพันธุ์ที่อพยพเร็วที่สุดในเจลอะกาโรส

•รูปแบบ Nicked (open circular/OC): การจัดเรียงเป็นวงกลมของ DNA พลาสมิดซึ่งมีการแตกหักของเส้นเดียวจะผ่อนคลายลงและทําให้เป็นรอย ไอโซฟอร์มนี้จึงย้ายได้ช้ากว่า DNA แบบซุปเปอร์คอยล์

•รูปแบบเชิงเส้น: การแตกหักของสายโควาเลนต์ทั้งสองของพลาสมิดส่งผลให้เกิดดีเอ็นเอเชิงเส้น พลาสมิดดีเอ็นเอรูปแบบนี้มีโครงสร้างเป็นแท่งและการย้ายถิ่นของมันช้ากว่าซุปเปอร์คอยล์ แต่เร็วกว่ารอยขีด

เมื่อวิเคราะห์คุณภาพของพลาสมิดดีเอ็นเอที่ใช้ในการผลิตวัคซีนพลาสมิดดีเอ็นเอหน่วยงานกํากับดูแลระดับสูงกําหนดให้การเตรียมประกอบด้วยพลาสมิดอย่างน้อย 80% ในรูปแบบซุปเปอร์คอยล์

ความสําคัญของโทโพโลยีพลาสมิดในการวิจัยและชีวเภสัชภัณฑ์

ในพลาสมิดดีเอ็นเอรูปแบบของไอโซฟอร์มมีผลต่อปัจจัยหลายประการในกระบวนการที่เกี่ยวข้องเกี่ยวกับวัคซีน:

•การถ่ายโอนไปยังเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม: รูปแบบ supercoiled ของ DNA พลาสมิดมีประสิทธิภาพสูงสุดในการถ่ายโอนเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมเมื่อเทียบกับรูปแบบที่ผ่อนคลายและเป็นเส้นตรง

•การผลิตวัคซีน mRNA: ความต้องการแม่แบบพลาสมิดเชิงเส้นสําหรับการถอดความในหลอดทดลอง (IVT) ทําให้เกิดสารปนเปื้อนพลาสมิดแบบวงกลมแบบเปิด ซึ่งส่งผลต่อผลผลิตและความสม่ําเสมอ

•การผลิตเวกเตอร์ยีนบําบัด: พลาสมิดซุปเปอร์คอยล์คุณภาพสูงเป็นสิ่งจําเป็นสําหรับการผลิตเวกเตอร์ที่เกี่ยวข้องกับอะดีโน (AAV)

•การตรวจสอบความเสถียร: สภาพการจัดเก็บและระยะเวลาในการจัดเก็บส่งผลต่อความเสถียรของพลาสมิดเนื่องจากความถี่ของรูปแบบรอยขีดข่วนหรือเชิงเส้นเพิ่มขึ้น

ความก้าวหน้าในการวิจัยล่าสุดในการวิเคราะห์ดีเอ็นเอพลาสมิด

การศึกษาล่าสุดสองชิ้นเน้นย้ําถึงความสําคัญของการแยกดีเอ็นเอพลาสมิดที่มีความละเอียดสูง:

1. ซิคกิ้งพลาสมิดที่เป็นสื่อกลางของ ZorE (2025)

การศึกษาที่ตีพิมพ์ใน Nature Communications (มีนาคม 2025) มุ่งเป้าไปที่ระบบป้องกันแบคทีเรียและแสดงให้เห็นถึงการควบคุมโทโพโลยีของพลาสมิด กลุ่มวิจัยภายใต้สถาบัน Zorya อธิบายถึงการเปลี่ยนแปลงอย่างช้าๆ ของ DNA พลาสมิด pSG483 แบบซุปเปอร์คอยล์เป็นรูปแบบรอยขีดข่วนและเป็นเส้นตรงโดยโปรตีน ZorE สิ่งนี้ถูกตั้งข้อสังเกตว่าเป็นกระบวนการที่ค่อยเป็นค่อยไป และการเปลี่ยนแปลงได้รับการวิเคราะห์เชิงปริมาณโดยใช้ ImageJ เพื่อทําการศึกษาความหนาแน่น มีการตั้งข้อสังเกตว่าพลาสมิดซุปเปอร์คอยล์ค่อยๆถูก ZorE (768 nM) ค่อยๆ กัดเมื่อฟักตัว 60 นาทีที่อุณหภูมิ 37 °C

[ซิคกิ้งพลาสมิดที่เป็นสื่อกลางของ ZorE (2025)]

*"ปฏิกิริยาหยุดลงโดยการเพิ่ม EDTA และ SDS และผลิตภัณฑ์ถูกแยกออกโดยใช้เจลอิเล็กโทรโฟรีซิสในบัฟเฟอร์ 1× TAE เจลอะกาโรส 1.4% และย้อมสีด้วย eb"* — การสื่อสารธรรมชาติ, 2025

การค้นพบนี้พบว่ามีความสําคัญต่อการศึกษาชิ้นส่วนดีเอ็นเอและปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนที่ดําเนินการโดยใช้ระบบเจล

2. โปรตีนซ่อมแซม DNA และ DNA ที่ไม่ใช่ B (2025)

สิ่งพิมพ์ PNAS จาก NIH ในเดือนมกราคม พ.ศ. 2025 แสดงให้เห็นว่าการใส่ไดนิวคลีโอไทด์ซ้ําลงในพลาสมิด pUC18 มีผลต่อการจับของโปรตีนซ่อมแซมที่ไม่ตรงกัน Mlh1-Pms1 EMSAs ทดสอบการจับโปรตีนที่ความเข้มข้นตั้งแต่ 25 nM ถึง 400 nM ทั้งใน DNA supercoiled และ linearized DNA ที่ไม่ใช่รูปแบบ B ขัดขวางการทํางานของการซ่อมแซมโปรตีนและเพิ่มความเข้าใจเกี่ยวกับความไม่เสถียรของ DNA

[ดีเอ็นเอที่ไม่ใช่ B และโปรตีนซ่อมแซมดีเอ็นเอ (2025)]

ข้อควรพิจารณาที่สําคัญในอิเล็กโทรโฟรีซิสของพลาสมิด DNA

ในอิเล็กโทรโฟรีซิสของพลาสมิด DNA การเพิ่มประสิทธิภาพของความละเอียดด้วยไฟฟ้าเป็นสิ่งสําคัญ

HE-50 ระบบเจลแนวนอน: ระบบทางเลือก

พื้นที่ HE-50 ระบบเจลแนวนอนจาก Longlight Technologyใช้การออกแบบที่สม่ําเสมอซึ่งเป็นประโยชน์ต่ออิเล็กโทรโฟรีซิสของพลาสมิดดีเอ็นเอ

1. การแยกคุณภาพสูง

•อิเล็กโทรดแพลตตินั่มบริสุทธิ์ 99.95%: องค์ประกอบการออกแบบที่สําคัญสําหรับการแก้ปัญหาซุปเปอร์คอยล์จากไอโซฟอร์มที่มีรอยขีดข่วน

•รูปแบบเจลที่ยืดหยุ่น: นักวิจัยสามารถเลือกขนาดเจลด้วยขนาดถาดใดก็ได้จากสี่ขนาด: 60×60 มม., 60×120 มม., 120×60 มม. และ 120×120 มม. ขนาดที่ใหญ่ที่สุดมีระยะการโยกย้ายที่ยาวพอที่จะเห็นภาพไอโซฟอร์มที่โยกย้ายอย่างใกล้ชิดด้วยความละเอียดที่สูงขึ้น

2. การออกแบบที่มุ่งเน้นผู้ใช้

•ถาดโหลดแบบมีไกด์พร้อมพื้นหลังสีดํา: ไม้บรรทัดเรืองแสงที่มีพื้นหลังสีเข้มช่วยให้สามารถจัดตําแหน่งปลายปิเปตกับหลุมอย่างระมัดระวังเมื่อใส่ตัวอย่างหลายตัวอย่างเพื่อเปรียบเทียบโดยตรง

•ถังโพลีคาร์บอเนตที่มีความโปร่งใสสูง: การออกแบบที่มองเห็นได้ชัดเจนพร้อมถังในตัวแสดงการโยกย้ายของด้านหน้าสีย้อมและกระบวนการอิเล็กโทรโฟรีซิสโดยไม่จําเป็นต้องเปิดถังและขัดจังหวะระบบ

3. ความปลอดภัยและประสิทธิภาพ

•ฝาปิดอัตโนมัติ: สวิตช์นิรภัยจะตัดไฟเมื่อเปิดฝาเพื่อขจัดอันตรายจากไฟฟ้าช็อตในขณะที่ผู้ใช้โหลดตัวอย่างหรือนําเจลาตินออก

•การใช้บัฟเฟอร์ต่ํา: ห้องโยกย้ายด้านล่างประกอบด้วยการออกแบบสะพานที่ใช้บัฟเฟอร์น้อยลงในขณะที่ให้สภาพแวดล้อมไอออนิกที่เพียงพอเพื่อดําเนินการอิเล็กโตรโฟรีซิสดีเอ็นเอที่สม่ําเสมอและเชื่อถือได้

ขั้นตอนในการวิเคราะห์ไอโซฟอร์มพลาสมิด

เพื่อให้ได้การแยก DNA ของพลาสมิดอย่างเหมาะสมที่สุดโดยใช้ระบบ HE-50:

• ทําเจลอะกาโรส: เลือกขนาดถาดใดก็ได้จากสี่ขนาดเพื่อหล่อเจลอะกาโรส 0.8-1.0% วิเคราะห์พลาสมิดที่มีขนาดระหว่าง 3 - 10 kb ด้วยเจลอะกาโรสบัฟเฟอร์ TAE 1×

• การเตรียมตัวอย่าง: รวมตัวอย่างพลาสมิด DNA กับสีย้อมโหลด ใช้พลาสมิดดีเอ็นเอ 200 - 500 ng อัตราส่วนของตัวอย่างสีย้อม: การโหลดสีย้อมสามารถเป็น 1:6, 1:3 หรือ 1:1.5 ใช้ปิเปตใส่ตัวอย่างสีย้อมพลาสมิดลงในหลุมอะกาโรส

• อิเล็กโทรโฟรีซิส: ควรใช้เจลที่มีขนาด 120 x 120 มม. ที่ 100 V สําหรับเจล 100 x 100 มม. ให้ใช้ 80V โบรโมฟีนอลสีน้ําเงินได้รับอนุญาตให้วิ่งเป็นเวลา 45-60 นาที อิเล็กโทรโฟรีซิสจะหยุดลงเมื่อสีย้อมถึง 2/3 ของทางลงไปด้านล่าง

• แสดงภาพและจัดทําเอกสาร: ฝาครอบโปร่งใสที่เปิดโล่งช่วยให้สามารถเคลือบ UV และถ่ายภาพเจลได้ในขณะที่ฝาครอบยังอยู่ เมื่อมีไม้บรรทัดโมเลกุลจะสังเกตเห็นการเรืองแสงในเชิงบวก

• หาปริมาณการกระจายไอโซฟอร์ม: ระบบเอกสารเจลอัตโนมัติจะวัดความเข้มของแถบ เปอร์เซ็นต์ของ DNA ซุปเปอร์คอยล์ถูกกําหนดโดยสิ่งต่อไปนี้: [ความเข้มของ SC] / (ความเข้มเชิงเส้น SC OC) × 100

การรวมเวิร์กโฟลว์ที่ไม่มีสิ่งกีดขวาง

ระบบ HE-50 ได้รับการออกแบบมาเพื่อการรวมเข้ากับเวิร์กโฟลว์ในห้องปฏิบัติการที่มีอยู่โดยไม่มีสิ่งกีดขวาง:

•การรวมพาวเวอร์ซัพพลาย: ปลั๊กกล้วยขนาด 4 มม. ที่จําเป็นเข้ากันได้กับแหล่งจ่ายไฟอิเล็กโทรโฟรีซิสส่วนใหญ่ (เราขอแนะนําแรงดันไฟฟ้าคงที่)

•การรวมระบบถ่ายภาพ: ฝาโปร่งใส UV เข้ากันได้กับระบบถ่ายภาพเอกสารเจลมาตรฐาน ทําให้ไม่จําเป็นต้องถ่ายโอนเจลจากถังไปยังเครื่องสร้างภาพ

•การยอมรับโปรโตคอล: ระบบนี้เข้ากันได้กับความเข้มข้นของเจลอะกาโรสมาตรฐานทั้งหมด และบัฟเฟอร์อิเล็กโทรโฟรีซิส (TAE, TBE, SB) ทําให้สามารถนําโปรโตคอลการวิเคราะห์พลาสมิดที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้มาใช้

บทสรุป

อิเล็กโทรโฟรีซิสของดีเอ็นเอเป็นวิธีที่ตรงไปตรงมาและเป็นที่นิยมที่สุดในการประเมินคุณภาพของดีเอ็นเอพลาสมิด นักวิจัยสามารถใช้ความรู้เกี่ยวกับการโยกย้ายของไอโซฟอร์มซุปเปอร์คอยล์ รอยขีด และเชิงเส้นเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการแยกและตีความผลลัพธ์ ระบบเจลแนวนอน HE-50 ให้ความสามารถ — อิเล็กโทรดแพลตตินั่มบริสุทธิ์ ขนาดเจลที่เลือกได้ คู่มือการโหลด และตัวควบคุม — จําเป็นสําหรับการวิเคราะห์พลาสมิดตามปกติ ตามที่ระบุไว้ใน Nature Communications (2025) และ NIH (2025) อิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรสเป็นหนึ่งในวิธีการพื้นฐานในการวิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ระหว่าง DNA และโปรตีน ตลอดจนโทโพโลยีหรือโครงสร้างของ DNA

ระบบเจลแนวนอน HE-50 มีศักยภาพในการบูรณาการอย่างสมบูรณ์และเป็นโมดูลาร์กับระบบการถ่ายภาพ ด้วยวิธีนี้ ทําให้ลูกค้ามีตัวเลือกมากขึ้นสําหรับระบบถ่ายภาพ DNA พลาสมิดราคาไม่แพง หากต้องการเรียนรู้เพิ่มเติม โปรดส่งคําขอใบเสนอราคาไปที่ Longlight Technology

คำถามที่ถามบ่อย

ไตรมาสที่ 1 อิเล็กโทรโฟรีซิสเจลแนวนอนสามารถระบุดีเอ็นเอพลาสมิดที่ขดลวดและรอยขดลวดได้หรือไม่?

ระบบ HE-50 สามารถระบุพลาสมิด DNA แบบซุปเปอร์คอยล์ รอยขีด และเชิงเส้น ตราบใดที่สนามไฟฟ้ามีความสม่ําเสมอ และใช้เจลอะกาโรส 0.8-1.2%

ไตรมาสที่ 2 อัตราการย้ายถิ่นที่แตกต่างกันของพลาสมิดรูปแบบต่างๆ ระหว่างอิเล็กโทรโฟรีซิสคืออะไร?

เนื่องจากรูปแบบพลาสมิดมีโครงสร้างแตกต่างกัน จึงมีอัตราการย้ายถิ่นที่แตกต่างกันเมื่ออยู่ภายใต้อิเล็กโทรโฟรีซิส ตัวอย่างเช่น รูปแบบพลาสมิดเชิงเส้นจะย้ายได้เร็วกว่ารูปแบบวงกลม ดีเอ็นเอในรูปแบบเชิงเส้นมีอัตราการย้ายถิ่นปานกลาง ในขณะที่ดีเอ็นเอในรูปแบบวงกลมที่มีรอยขีดข่วนหรือแบบเปิดมีอัตราการย้ายถิ่นที่ช้าที่สุด

ไตรมาสที่ 3 ดีเอ็นเอซุปเปอร์คอยล์ถือว่ามีคุณภาพสูงสําหรับการถ่ายโอนกี่เปอร์เซ็นต์?

รูปแบบซุปเปอร์คอยล์ของพลาสมิดดีเอ็นเอที่มีมากกว่า 80% โดยทั่วไปถือเป็นการเตรียมพลาสมิดคุณภาพสูงสําหรับการถ่ายโอนและการบําบัดด้วยยีน

ไตรมาสที่ 4 ฉันสามารถใช้บัฟเฟอร์ TAE แทน TBE ในการแยกไอโซฟอร์มพลาสมิดได้หรือไม่

ได้ ในกรณีส่วนใหญ่ บัฟเฟอร์ TAE สามารถใช้สําหรับการวิเคราะห์พลาสมิดได้ อย่างไรก็ตาม บัฟเฟอร์ TBE เหมาะสมที่สุดสําหรับการแยกไอโซฟอร์มพลาสมิดเมื่อความแตกต่างน้อยที่สุดและในการแยกที่ขยายออกไป

ไตรมาสที่ 5 เหตุใดตัวอย่างพลาสมิดของฉันจึงแสดงแถบหลายแถบบนเจล

โดยปกติแล้วจะสังเกตเห็นแถบหลายแถบสําหรับพลาสมิดแบบซุปเปอร์คอยล์ รอยขีดข่วน และเชิงเส้น แถบอื่นๆ อาจเป็นผลมาจากการย่อยอาหารไม่ดีหรือการปนเปื้อนของ DNA และ RNA ที่เสื่อมสภาพ