คู่มือการเพิ่มประสิทธิภาพสําหรับการกระจายตัวของ DNA ในตัวอย่างที่ยากต่อการสลาย

การกระจายตัวของดีเอ็นเอเป็นขั้นตอนสําคัญในการเตรียมตัวอย่างในหลากหลายสาขาวิชา รวมถึงจีโนม การวินิจฉัยระดับโมเลกุล และโปรตีโอมิกส์ อย่างไรก็ตาม การมีผนังเซลล์ที่แข็งแรงหรือเนื้อเยื่อแข็งก่อให้เกิดความท้าทายที่สําคัญในการกระจายตัวของ DNA ที่มีคุณภาพสูงและสม่ําเสมอ คู่มือนี้กล่าวถึงปัญหาที่เกี่ยวข้องกับสิ่งมีชีวิตและเนื้อเยื่อที่ดื้อรั้นต่อการสลาย ให้คําแนะนําในการเพิ่มประสิทธิภาพตามหลักฐาน และกล่าวถึงข้อดีของเทคโนโลยีอัลตราซาวนด์แบบโฟกัส

[การกระจายตัวของดีเอ็นเอ | AAT ไบโอเควสท์]

ความท้าทายที่เกี่ยวข้องกับตัวอย่างที่ดื้อรั้นในการสลายตัว

ตัวอย่างทางชีวภาพที่พบในห้องปฏิบัติการวิจัยและคลินิกครอบคลุมอาณาจักรจุลินทรีย์และพืช ผนังเซลล์ที่แข็งแรงของสิ่งมีชีวิต เช่น ไมโคแบคทีเรียและสายพันธุ์ที่สร้างสปอร์ ตลอดจนเนื้อเยื่อพืชที่อุดมด้วยเซลลูโลสและลิกนิน

อะไรทําให้บางตัวอย่างไม่เต็มใจที่จะสลายตัว?

• เมื่อเทียบกับเซลล์สัตว์ เยื่อหุ้มเซลล์ของแบคทีเรียแกรมบวก ไมโคแบคทีเรีย เชื้อรา และพืชต้องการพลังงานมากกว่า ทั้งทางกลหรือทางเคมี

การสลายไม่เพียงพอมีผลอย่างไร?

• การหยุดชะงักของตัวอย่างที่ไม่ดีส่งผลให้ DNA ให้ผลผลิตต่ํา ไลบรารีการจัดลําดับที่มีอคติ และผลกระทบปลายน้ําของ PCR เช่น ประสิทธิภาพต่ําและการหาปริมาณที่ไม่ดี

สําหรับตัวอย่างประเภทดังกล่าววิธีการมาตรฐานเช่นการย่อยด้วยสารเคมีรอบการแช่แข็งละลายและการตีลูกปัดขึ้นอยู่กับการใช้การหยุดชะงักทางกลที่มีการควบคุมมากขึ้นเนื่องจากผลลัพธ์ที่ไม่สอดคล้องกัน

ความก้าวหน้าในการทําความเข้าใจเกี่ยวกับการกระจายตัวของดีเอ็นเอ

การค้นพบทางวิทยาศาสตร์ที่สําคัญสร้างรากฐานสําหรับการทําความเข้าใจการกระจายตัว ในการศึกษาครั้งสําคัญในปี 2025 Fu et al. ได้คิดค้นวิธีการเฉือนอัลตราโซนิกที่สื่อกลางโดยลูกปัดเซอร์โคเนีย ซึ่งด้วยการใช้ sonication เพียง 20 วินาที สามารถให้ขนาดชิ้นส่วนประมาณ 15 กิโลเบสคู่จาก λDNA ที่บริสุทธิ์ วิธีนี้ผลักดันขอบเขตของการจัดลําดับโมเลกุลเดี่ยว (SMS) โดยให้วิธีแก้ปัญหาคอขวดของการผลิตชิ้นส่วน ≥10 kbp ที่ไม่มีประสิทธิภาพโดยใช้เทคนิคการตัดอัลตราโซนิกแบบดั้งเดิมสําหรับการเตรียมห้องสมุด SMS

[กลยุทธ์อัลตราโซนิกที่เป็นสื่อกลางของลูกปัดเซอร์โคเนียที่รวดเร็วและมีประสิทธิภาพสําหรับ

การกระจายตัวของดีเอ็นเอสูงถึง 10 kbp - RSC Advances]

ในงานสําคัญอีกชิ้นหนึ่งที่ตีพิมพ์ในปี 2025 Hahmann และเพื่อนร่วมงานจากสถาบัน Max Planck Institute for Polymer Research และ RWTH Aachen University อธิบายถึงการใช้อัลตราซาวนด์เพื่อให้เกิดการกระจายตัวของ DNA ที่ควบคุมตามลําดับ งานนี้อธิบายการเปลี่ยนเส้นทางของการกระจายตัวแบบสุ่มก่อนหน้านี้ไปยังจุดอ่อนที่เฉพาะเจาะจงและจงใจของสาย DNA ที่แยกออกบางส่วนโดยใช้ชื่อเล่น ตีพิมพ์ในวารสาร Chem งานนี้นําเสนอแนวคิดใหม่และมิติพิเศษสําหรับการพัฒนาโปรโตคอลเพื่อให้เกิดการกระจายตัวอย่างที่ซับซ้อนและท้าทาย

ความท้าทายและข้อควรพิจารณาในการกระจายตัวของดีเอ็นเอ

[โยฮันเนส ฮาห์มันน์, บอริส เอ็น. ชุปป์, อามาน อิชากัต, อาร์ชุนา เซลวากุมาร์,

Robert Göstl, Frauke Gräter และ Andreas Herrmann

"กลไกเคมีเฉพาะลําดับที่ปราศจากกลไกของ DNA" เคมี (2025).]

เพื่อให้เกิดการกระจายตัวของ DNA ในตัวอย่างที่ดื้อยา ต้องควบคุมและปรับแต่งพารามิเตอร์จํานวนหนึ่งอย่างละเอียด ผลลัพธ์สามารถปรับปรุงได้โดยการปรับสิ่งต่อไปนี้:

•ความเข้มและแอมพลิจูดของอัลตราซาวนด์: ความเข้มที่สูงขึ้นทําให้เกิดโพรงอากาศมากขึ้นและการหยุดชะงักที่ดีขึ้น ความเข้มที่สูงขึ้นยังเพิ่มความเสี่ยงของความเสียหายจากความร้อนและทางกลต่อตัวอย่าง

•เวลาในการประมวลผล: Sonication เป็นเวลานานอาจนําไปสู่การกระจายตัวมากเกินไปที่ยอมรับไม่ได้

• ปริมาตรและความเข้มข้นของตัวอย่าง: พลังงานอินพุตสําหรับตัวอย่างเจือจางและเข้มข้นจะแตกต่างกัน ควรวัดความแตกต่างนี้เพื่อกําหนดปริมาตรตัวอย่างที่เหมาะสมที่สุด

• องค์ประกอบของบัฟเฟอร์: การใช้ผงซักฟอกและคีเลเตอร์ทําให้ผนังเซลล์อ่อนแอลงและได้รับการปรับปรุงโดยการหยุดชะงักทางกล

• การควบคุมอุณหภูมิ: การสูญเสียความเสถียรของความร้อนอาจทําให้ตัวอย่างที่แยกส่วนเปลี่ยนสภาพและสูญเสียความสมบูรณ์ของโครงสร้าง สิ่งนี้สามารถเกิดขึ้นได้หากระบบอยู่ในสภาวะไอโซเทอร์มอล

• จํานวนลูกปัดและขนาด: ในการแยกส่วนของลูกปัด ขนาดและจํานวนของลูกปัดมีความสําคัญ

Saputra et al. (2024) เปรียบเทียบวิธีการสกัดดีเอ็นเอหลายวิธี พวกเขาแสดงให้เห็นว่า sonication ส่งผลให้ดีเอ็นเอคุณภาพสูง จากข้อมูลของพวกเขา 61% ของ DNA ที่ sonicated มีค่าการดูดกลืนแสงระหว่าง 1.8 ถึง 2.0 โดยพื้นหลังความยาวคลื่นที่ต่ํากว่าจะเด่นชัดน้อยกว่า ในทางตรงกันข้าม การสกัดดีเอ็นเอโดยใช้วิธีคอลัมน์สปินส่งผลให้ได้ผลผลิตดีเอ็นเอที่สกัดได้สูงขึ้น นี่แสดงให้เห็นว่าในวิธีการวินิจฉัยบางอย่าง ความบริสุทธิ์ของตัวอย่างอาจมีความสําคัญมากกว่าความเข้มข้นของตัวอย่าง

เทคโนโลยีอัลตราซาวนด์ที่โฟกัส: ทางเลือกที่แม่นยํา

เทคนิคทั่วไปของวิธีการ sonication มีข้อเสียหลายประการ โพรบ sonicators ทําให้เกิดการปนเปื้อนของตัวอย่างและต้องมีการทําความสะอาดอย่างเข้มข้นและในที่สุดก็เป็นสาเหตุของความร้อนที่ไม่สามารถควบคุมได้ของตัวอย่าง เครื่อง sonicator อ่างน้ํากระจายพลังงานและให้ผลลัพธ์ที่ไม่สอดคล้องกัน

แพลตฟอร์มอัลตราซาวนด์ที่โฟกัส เช่น โบฟู-800ให้ใช้การออกแบบที่แตกต่างไปจากเดิมอย่างสิ้นเชิง การกําจัดการสูญเสียพลังงานและให้ผลลัพธ์ที่ทําซ้ําได้สูงและความน่าเชื่อถือเมื่อประมวลผลตัวอย่างที่ยากเป็นเพียงข้อดีเพิ่มเติมบางส่วนของ sonication

•การประมวลผลแบบไม่สัมผัส: ระบบพลังงานที่มุ่งเน้น sonicate ในตัวกลางอะคูสติกไปยังตัวอย่าง การสัมผัสตัวอย่าง/โพรบจะถูกกําจัดออกไปและไม่น่าจะเกิดการปนเปื้อนของตัวอย่าง

•การควบคุมอุณหภูมิต่ําที่แท้จริง: ความร้อนของการประมวลผลอัลตราโซนิกไม่มีผลต่อผลลัพธ์ ด้วยการวัดและควบคุมอุณหภูมิที่ได้รับการปรับปรุง เราจึงสามารถเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิภายในตัวอย่างได้อย่างแม่นยําและรอบคอบ

• ปริมาณงานที่ปรับเปลี่ยนได้: แต่ละตําแหน่งตัวอย่างทั้งแปดตําแหน่งสามารถมีการตั้งค่าผู้ใช้แบบกําหนดเองได้ ผู้ใช้ยังสามารถประมวลผลตัวอย่างได้ตั้งแต่หนึ่งถึงแปดตัวอย่าง ระบบช่วยให้ปริมาณงานมีความยืดหยุ่น

•โหมดการประมวลผลแบทช์: เมื่อตัวอย่างในแต่ละตําแหน่งเหมือนกันการตั้งค่าแบบกําหนดเองสามารถใช้กับตําแหน่งตัวอย่างทั้งหมดได้ สิ่งนี้ทําให้ผู้ใช้สามารถประมวลผลตําแหน่งตัวอย่างได้หลายตําแหน่งด้วยคําสั่งเดียว

• การตรวจสอบย้อนกลับได้อย่างสมบูรณ์: ข้อมูลเกี่ยวกับการประมวลผลของแต่ละตัวอย่างสามารถเข้าถึงได้ตลอดเวลา

การประยุกต์ใช้กับประเภทตัวอย่างเฉพาะ

ไมโคแบคทีเรีย

ผนังเซลล์ของ Mycobacterium tuberculosis อุดมไปด้วยกรดไมโคลิกและเจาะได้ยากมาก อัลตราซาวนด์แบบโฟกัสจะสร้างโพรงอากาศเชิงกลและทําให้ผนังเซลล์แตกเพื่อทําขั้นตอนการสลายแกนกลางให้เสร็จสมบูรณ์ในเวลาประมาณ 60 วินาที เวลาทั้งหมดในการดําเนินการให้เสร็จสิ้นตั้งแต่การเพาะเลี้ยงอาณานิคมไปจนถึงสารสกัดตัวอย่างน้อยกว่าห้านาที

เชื้อราเส้นใย

ผนังเซลล์ของเชื้อราเส้นใยประกอบด้วยไคตินและกลูแคน แม้ว่าจะเจาะได้ยาก แต่อัลตราโซนิกแบบโฟกัสสามารถลดเวลาในการเตรียมตัวอย่างให้เหลือน้อยกว่าห้านาทีและใช้เวลาเพียง 60 วินาทีในการ sonication

วัสดุจากพืช

องค์ประกอบหลักของผนังเซลล์พืชคือลิกนินและเซลลูโลส สําหรับอัลตราซาวนด์แบบโฟกัสความสามารถในการทําให้เป็นเนื้อเดียวกันและการกระจายตัวอย่างสม่ําเสมอเป็นสิ่งสําคัญสําหรับการตอบสนองความต้องการที่หลากหลายตั้งแต่การสกัดดีเอ็นเอของเนื้อเยื่อพืชและสัตว์

ตัวอย่าง FFPE

สําหรับเนื้อเยื่อ FFPE การเชื่อมขวางฟอร์มาลดีไฮด์นําเสนอความท้าทายในทุกขั้นตอนของกระบวนการ อัลตราซาวนด์แบบโฟกัสช่วยเพิ่มความคล่องตัวในการเตรียมตัวอย่างโดยการรวมการแยกพาราฟิน การสลาย และการกระจายตัวของ DNA ไว้ในขั้นตอนเดียวที่รวดเร็วและมีประสิทธิภาพ

ตัวอย่างโปรโตคอลที่เหมาะสมที่สุด

เมื่อทํางานกับตัวอย่างประเภทใหม่ที่ยากต่อการสลายกลยุทธ์การพัฒนาโปรโตคอลที่มีประสิทธิภาพสูงสุดมีดังนี้:

• ใช้การตั้งค่าของผู้ผลิตเป็นพื้นฐาน: บ่อยครั้งที่โปรโตคอลเฉพาะประเภทตัวอย่างได้รับการสอบเทียบล่วงหน้าและสามารถวางใจได้

• กําหนดขนาดส่วนย่อยที่ยอมรับได้: สําหรับ NGS ขนาดส่วนย่อยของการสร้างห้องสมุดมักจะอยู่ระหว่าง 300 ถึง 500 bp ในขณะที่การจัดลําดับแบบอ่านยาวจะอยู่ที่ ≥ 10 kbp พิจารณาขนาดที่เหมาะสม

• ระยะเวลาของแรงเฉือนคงที่ในการทดลองตามเวลา: ปรับความยาวของกรอบเวลาให้เหมาะสม

• การตรวจสอบความถูกต้องของอิเล็กโตรโฟรีซิส: ในการศึกษาหลักสูตรเวลา ให้พิจารณาการเตรียมตัวอย่างและขนาดชิ้นส่วน

• จัดทําเอกสารและสื่อสารพารามิเตอร์ที่จําเป็นทั้งหมด: สําหรับขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างที่จะทําซ้ําได้ทุกประการ จะต้องจัดทําเป็นเอกสารอย่างครบถ้วนในโปรโตคอลที่เกี่ยวข้อง

• การควบคุมความร้อน: อุณหภูมิตัวอย่างต้องอยู่ในช่วงอุณหภูมิเป้าหมายเพื่อหลีกเลี่ยงการนําสิ่งประดิษฐ์ทางความร้อนเข้ามา

ทิศทางในอนาคต

หลังจากการศึกษาที่อ้างถึงก่อนหน้านี้บางส่วนตั้งแต่ปี 2025 เราจะยังคงเห็นการบูรณาการการวินิจฉัยทางคลินิกและวิศวกรรมเข้ากับอณูชีววิทยาซึ่งนําไปสู่การสร้างเครื่องมือขั้นสูงและทรงพลังยิ่งขึ้นสําหรับการกระจายตัวของดีเอ็นเอ

Lei และคณะแสดงให้เห็นว่าอุปกรณ์อัลตราซาวนด์ที่เน้นความเข้มสูงขนาดเล็กพร้อมความสามารถในการจับคู่การกระจายตัวอย่างของอุปกรณ์เชิงพาณิชย์สามารถแก้ปัญหาการปนเปื้อนข้ามและการประมวลผลที่ไม่สอดคล้องกับระบบแบบเดิมได้อย่างไร นี่เป็นขั้นตอนสู่การสกัดกรดนิวคลีอิกแบบอัตโนมัติและบูรณาการมากขึ้น และการเตรียมตัวอย่างในห้องปฏิบัติการจะได้มาตรฐานและพร้อมใช้งานมากขึ้น

สําหรับห้องปฏิบัติการวิจัยและการวินิจฉัยที่ผสมผสานเทคโนโลยีอัลตราซาวนด์แบบโฟกัสเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการกระจายตัวสําหรับตัวอย่างที่ยากต่อการสลายประโยชน์ของเทคโนโลยีอัลตราซาวนด์แบบโฟกัสซึ่งรวมถึงความแม่นยําความสะดวกในการใช้งานและความสามารถในการทําซ้ํานั้นน่าสนใจ การผสมผสานระหว่างเวิร์กโฟลว์ที่ผ่านการตรวจสอบแล้วสําหรับตัวอย่างประเภทต่างๆ เช่น ไมโคแบคทีเรีย เชื้อราเส้นใย เนื้อเยื่อพืช และส่วน FFPE บนอุปกรณ์เครื่องเดียว ช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพของห้องปฏิบัติการและคุณภาพของข้อมูลที่สร้างขึ้น และปรับปรุงและเร่งการแปลการวิจัยทางวิทยาศาสตร์และการปฏิบัติทางคลินิก

คําถามที่พบบ่อย

ไตรมาสที่ 1 การกระจายตัวของดีเอ็นเอคืออะไร? มีบทบาทอย่างไรสําหรับตัวอย่างที่ยากต่อการสลาย?

A. การกระจายตัวของ DNA เป็นสิ่งจําเป็นสําหรับการเตรียมไลบรารี NGS การกระจายตัวนั้นกําลังแบ่ง DNA ออกเป็นชิ้นเล็กๆ การจัดลําดับรุ่นต่อไปใช้การวิเคราะห์ดีเอ็นเอกับตัวอย่างที่ยากต่อการสลาย เช่น พืชและแบคทีเรีย ซึ่งต้านทานการสลายแบบเดิม

ไตรมาสที่ 2 อัลตราซาวนด์แบบโฟกัสสามารถเจาะ mycobacteria โดยไม่ต้องปรับสภาพสารเคมีได้หรือไม่?

A. อัลตราซาวนด์ที่โฟกัสให้พลังงานและความเครียดที่เพียงพอแก่ชั้นไมโคลิกของไมโคแบคทีเรีย และด้วยเหตุนี้จึงอาจลดการบําบัดด้วยสารเคมีหรือกําจัดมันทั้งหมด

ไตรมาสที่ 3 อัลตราซาวนด์แบบโฟกัสแตกต่างจากการตีลูกปัดสําหรับเนื้อเยื่อพืชอย่างไร?

A. อัลตราซาวนด์แบบโฟกัสเป็นแบบไม่สัมผัสและแบบไอโซเทอร์มอลให้การรักษาเชิงกลที่สม่ําเสมอและเฉือนมากขึ้นซึ่งอํานวยความสะดวกในการควบคุมและลดการเสื่อมสภาพของเนื้อเยื่อได้มากขึ้นเมื่อเทียบกับการตีลูกปัด

ไตรมาสที่ 4 ขนาดโดยทั่วไปของชิ้นส่วน DNA เมื่อใช้อัลตราโซนิกแบบโฟกัสคืออะไร?

A. ขนาดชิ้นส่วนอาจแตกต่างกันอย่างมากมากกว่า 10 kb และอาจใช้อัลตราซาวนด์เพื่อกําหนดเป้าหมายชิ้นส่วน 300-500 เบส ในขณะที่ขนาดทั่วไปสําหรับการจัดลําดับรุ่นต่อไปอยู่ที่ประมาณ 300-500 เบส

ไตรมาสที่ 5 อัลตราซาวนด์แบบโฟกัสใช้ได้กับการแยกส่วน DNA จาก FFPE หรือไม่?

ตอบ: อัลตราซาวนด์แบบโฟกัสสามารถบรรลุการ deparaffinization FFPE และการสลายเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพในขณะที่ตัด DNA แบบเชื่อมขวาง กระบวนการโฟกัสอัลตราซาวนด์นั้นรวดเร็วและเพิ่มผลผลิตโดยรวมของ DNA ที่แยกส่วน