การถ่ายภาพด้วยอิเล็กตรอนเย็น (Cryo-ET): ตัวอย่างของคุณพร้อมสําหรับชีววิทยาโครงสร้างในสถานที่จริงหรือยัง?

การประยุกต์ใช้ที่ดูมีแนวโน้มมากที่สุดของการถ่ายภาพด้วยอิเล็กตรอนแช่แข็งไม่ใช่แค่คําถามว่า "โปรตีนนี้มีหน้าตาอย่างไร?" แต่ยังรวมถึง "โครงสร้างนี้หน้าตาเป็นอย่างไรในจุดที่มันทํางานจริง ๆ?"

ความแตกต่างนี้สําคัญ คอมเพล็กซ์ที่ผ่านการทําให้บริสุทธิ์ยังสามารถให้รายละเอียดโครงสร้างที่สมบูรณ์แบบในขณะที่กําจัดเยื่อหุ้มเซลล์ คอมเพล็กซ์ที่อยู่ติดกัน โครงสร้างเซลล์ หรือโครงสร้างไวรัสที่สําคัญต่อการศึกษาทางชีววิทยา Cryo-ET รับมือกับความท้าทายนี้ในรูปแบบที่แตกต่าง โดยใช้การฉายภาพหลายครั้งของตัวอย่างในกระจกมาสร้างปริมาตรสามมิติขึ้นมาใหม่

ปัจจุบัน Longlight นําเสนอ Cryo-ET ในฐานะแนวทางโครงสร้างในสถานที่สําหรับชุดประกอบทางชีวภาพ คอมเพล็กซ์ที่เกี่ยวข้องกับเยื่อหุ้ม และระบบไวรัส เป็นส่วนหนึ่งของ บริการกล้องจุลทรรศน์แบบครายโออิเล็กตรอน.

อย่างไรก็ตาม คําถามในทางปฏิบัติสําหรับการเก็บข้อมูลคือ

คําถามทางชีววิทยาจริง ๆ แล้วเป็นเรื่องที่ต้องทําโทโมแกรมจริงหรือ?

ลองพิจารณาคําถามทางชีววิทยาก่อนกล้องจุลทรรศน์

บางครั้งนักวิทยาศาสตร์เปรียบเทียบ Cryo-ET กับการวิเคราะห์อนุภาคเดี่ยว โดยเสนอว่าต้องมีสิ่งใดดีกว่าอีกสิ่งหนึ่ง

โดยทั่วไปแล้วมันไม่ใช่การเปรียบเทียบแบบเปรียบเป๊ะ

การแช่แข็ง-EM แบบอนุภาคเดียวอาจเป็นเส้นทางที่ตรงไปกว่าสู่โครงสร้างเฉลี่ยความละเอียดสูง หากคอมเพล็กซ์มาโครโมเลกุลที่บริสุทธิ์และค่อนข้างเป็นเนื้อเดียวกันสามารถตอบคําถามทางชีววิทยาได้ อย่างไรก็ตาม Cryo-ET จะน่าสนใจมากหากตําแหน่ง/ทิศทาง สภาพแวดล้อมโมเลกุล สภาพแวดล้อมของเยื่อหุ้มเซลล์ หรือการจัดระเบียบเซลล์ของเป้าหมายมีความเกี่ยวข้อง

Longlight's คู่มือสําหรับ Cryo-EM ความละเอียดใกล้เคียงอะตอม ให้ข้อมูลพื้นฐานเกี่ยวกับเส้นทางอนุภาคเดี่ยว; Cryo-ET ตั้งคําถามอีกข้อหนึ่ง: จะเห็นอะไรได้บ้างเมื่อบริบททางชีววิทยายังคงอยู่?

ขีดจํากัดทางกายภาพแรก—การเข้าถึงของอิเล็กตรอน

ถ้าตัวอย่างนั้นน่าสนใจทางชีววิทยา ไม่ได้หมายความว่าตัวอย่างนั้นสามารถเข้าถึงได้ด้วยอิเล็กตรอนเสมอไป

การตรวจเอกซเรย์แบบไครโอเจนิกโดยตรงอาจเป็นไปได้สําหรับไวรัสหรือออร์แกเนลล์ที่แยกตัว เซลล์ขนาดเล็ก และบริเวณรอบนอกที่บางของเซลล์ กระบวนการทํางานในสถานที่บางแบบรวมถึงการทําให้ตัวอย่างบางลง ซึ่งจําเป็นสําหรับการถ่ายภาพการส่งผ่านเซลล์อีโอซินิวคลีอิกขนาดใหญ่ที่หนาเกินกว่าจะถ่ายภาพได้

วิธีที่ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางในการทําแผ่นบางของเซลล์คือการกัดด้วยลําแสงไอออนโฟกัสแบบเย็น (FIB) เซลล์ยูคาริโอตที่ผ่านการบดด้วยไครโอ-FIB ถูกใช้ในการศึกษาที่สถานที่จริง เพื่อให้โครงสร้างภายในสามารถเข้าถึงได้สําหรับการถ่ายภาพเอกซเรย์และการวิเคราะห์โครงสร้างในภายหลัง

การวางแผนตัวอย่างไม่ควรเริ่มต้นด้วยแรงดันไฟฟ้าของกล้องจุลทรรศน์! ควรมีคําว่า 'จากที่ไหน' และ 'อย่างไร' ลําอิเล็กตรอนจะไปถึงเป้าหมาย

Tilt Series ไม่ใช่กองรูปภาพ แต่มันคืองบประมาณปริมาณรังสี

Cryo-ET ไม่ได้รับข้อมูลเกี่ยวกับมิติที่สามจากการสัมผัสเพียงครั้งเดียว

ตัวอย่างนี้ถูกเอียงหลายครั้งและจับภาพฉายภาพ 2 มิติหลายชุด สาเหตุนี้เกิดจากความไวต่อรังสีของตัวอย่างชีวภาพแช่แข็ง และการฉายภาพจึงต้องได้รับงบประมาณปริมาณอิเล็กตรอนรวมที่จํากัด ความหนาที่มีประสิทธิภาพที่อิเล็กตรอนผ่านจะเพิ่มขึ้นเมื่อมีมุมเอียงมากขึ้น ซึ่งหมายความว่าสัญญาณที่ใช้งานได้อาจน้อยลง

ในโทโมกราฟีแบบดั้งเดิม การเก็บภาพ ±90° อย่างสมบูรณ์ก็เป็นไปไม่ได้เนื่องจากรูปทรงทางกลและความหนาของตัวอย่าง ข้อมูลที่ไม่ได้สุ่มตัวอย่างสร้างลิ่มที่หายไปซึ่งเป็นที่รู้จักกันดีในพื้นที่ฟูเรียร์

แต่การคาดการณ์มากขึ้นไม่ได้หมายความว่าจะดีกว่าเสมอไป ต้องพิจารณาความสัมพันธ์ระหว่างช่วงการเอียง การกระจายปริมาณรังสี คุณภาพของการจัดแนว ความมั่นคงของตัวอย่าง และการมองเห็นของเป้าหมาย

ตรวจสอบว่าคุณต้องการโทโมแกรม ซึ่งเป็นโครงสร้างซ้ําหรือไม่

ไม่ใช่ทุกโครงการ Cryo-ET จะต้องจบลงด้วยโมเดลโมเลกุลเกือบอะตอม!

บ่อยครั้งที่การตรวจเอกซเรย์เพียงอย่างเดียวก็ให้คําตอบสําหรับคําถามว่า: โครงสร้างตั้งอยู่ที่ไหน? แล้วเมมเบรนจะเกิดอะไรขึ้นเมื่อมันบิดเบี้ยว? องค์ประกอบของไวรัสมีการจัดระเบียบอย่างไร? คอมเพล็กซ์ไหนที่อยู่ติดกัน?

เป้าหมายที่แตกต่างกันจะแสดงเมื่อมีสําเนาหลายชุดของคอมเพล็กซ์มาโครโมเลกุลเดียวกัน เป้าหมายที่ทําซ้ําสามารถสกัดออกมาเป็นซับโทโมแกรม จัดแนว จัดประเภท และเฉลี่ยเพื่อเสริมสร้างสัญญาณโครงสร้าง

ในบทความนี้ ลองไลท์ได้อธิบายเส้นทางนี้อย่างละเอียดแล้ว ประเด็นสําคัญสําหรับโปรเจกต์ใหม่จึงถูกตั้งขึ้นตั้งแต่ต้น: สถาปัตยกรรม 3 มิตินี้มีเอกลักษณ์หรือไม่ หรือมีสําเนาที่คล้ายกันเพียงพอสําหรับการเฉลี่ย?

คอขวดที่ซ่อนอยู่นี้อาจกลายเป็นการระบุตําแหน่งเป้าหมายได้

การเลือกพื้นที่มือถือที่ดีที่สุดอาจสําคัญพอ ๆ กับการได้ชุด tilt ที่มีคุณภาพทางเทคนิค

สมมติว่าเป้าหมายเป็นเพียงส่วนเล็ก ๆ ของเซลล์ขนาดใหญ่ แม้ว่าคุณจะได้ภาพโทโมแกรมสวย ๆ จากพื้นที่ผิด แต่มันก็ยังเป็นชุดข้อมูลที่ไม่ถูกต้องอยู่ดี

ดังนั้น เพื่อที่จะเก็บรวบรวม ควรพิจารณาถึงความอุดมสมบูรณ์ของเป้าหมาย ตําแหน่งโดยประมาณของเซลล์ รูปร่างที่สามารถจดจําได้ ข้อมูลที่มีเกี่ยวกับการติดป้าย และว่าจําเป็นต้องมีกลยุทธ์การระบุตําแหน่งอื่นหรือไม่

แผนที่ชีวภาพนี้สามารถเสริมสร้างตรรกะของแผนการเก็บรักษาสําหรับเป้าหมายที่เกี่ยวข้องกับเยื่อหุ้มเซลล์ จุดรวมตัวของไวรัส ออร์แกเนลล์ หรือคอมเพล็กซ์ที่มีข้อจํากัดทางพื้นที่ได้อย่างมาก

การวางแผนก่อนเซสชันสําหรับ Data Path:

เมื่อได้ซื้อชุด tilt-series แล้ว โครงการ Cryo-ET จะยังไม่เสร็จสมบูรณ์

ภาพเหล่านี้ต้องถูกจัดเรียงใหม่ สร้างใหม่เป็นโทโมแกรม และตรวจสอบ ค้นหาเป้าหมายและแบ่งส่วน และถ้าเหมาะสม ก็ต้องถ่ายโอนไปยังการสกัดอนุภาค การจัดประเภท และการเฉลี่ยซับโทโมแกรม

นั่นคือเหตุผลที่งานที่ต้องการควรถูกกําหนดล่วงหน้าก่อนการเก็บรวบรวม

ในบริการ Cryo-EM ปัจจุบันของ Longlight เรามุ่งเน้นที่การส่งมอบแผนที่ความหนาแน่นขั้นสุดท้าย รวมถึงข้อมูลดิบและไฟล์ประมวลผลระหว่างทาง สิ่งนี้มีประโยชน์เมื่อผู้วิจัยต้องการตรวจสอบการตัดสินใจประมวลผล ทําการวิเคราะห์เพิ่มเติมภายในระบบ หรือกลับมาดูชุดข้อมูลในภายหลัง

จับคู่แพลตฟอร์มกับขั้นตอนของโครงการ

คุณภาพของเครื่องมือไม่ควรถูกนํามาใช้ในการแก้ปัญหาตัวอย่างที่ไม่แน่นอน

การคัดกรองเบื้องต้นสามารถบ่งชี้ได้ว่าควรปรับปรุงการเตรียมตัวอย่าง การกระจายอนุภาค คุณภาพน้ําแข็ง และ/หรือการมองเห็นเป้าหมายก่อนที่จะลงทุนเวลาเก็บตัวอย่างที่มีค่าใช้จ่ายสูง

วันนี้ Longlight ประกาศแพลตฟอร์ม cryo-EM แบบแบ่งขั้นตอน ประกอบด้วย Talos L120C G2 สําหรับการคัดกรอง, Glacios 2 ที่ 200 kV สําหรับการตรวจ cryo-EM/โทโมกราฟีตามปกติ และ Titan Krios G4 ที่ 300 kV สําหรับการเก็บข้อมูลระดับสูงที่ต้องการ นอกจากนี้ยังเชื่อมโยงกับกระบวนการโปรตีนต้นน้ําผ่านกระบวนการที่กว้างขึ้น การประยุกต์ใช้โปรตีน พอร์ตโฟลิโอที่จับคู่การวิเคราะห์โครงสร้างกับพอร์ตโฟลิโอของตน

กฎคร่าว ๆ สําหรับการวิจัยคือ:

ตัวอย่างพร้อมแล้ว ไปหาเครื่องดนตรีถัดไป ไม่ใช่เพราะมีให้ใช้

นี่คือการตรวจสอบโครงการ Cryo-ET ครั้งสุดท้าย

เกี่ยวกับการนําตัวอย่างไปทําโทโมกราฟีอิเล็กตรอนแบบครายโอ มีคําถามห้าข้อที่ควรพิจารณา:

จําเป็นต้องมีบริบทเชิงพื้นที่แบบพื้นเมืองหรือไม่? พื้นที่ที่สนใจในโมเลกุลนั้นสามารถเข้าถึงได้โดยอิเล็กตรอนหรือไม่? มีเป้าหมายที่เชื่อถือได้ไหม? อี๋ โทโมแกรมเดียวหรืออนุภาคซ้ํากัน? คุณรู้ไหมว่าผลิตภัณฑ์ข้อมูลประเภทใดที่จะต้องใช้หลังจากการเข้าซื้อ?

เมื่อได้คําตอบแล้ว การเลือกอุปกรณ์และกลยุทธ์การแปรรูปก็ง่ายขึ้นมาก

พลังของ cryo-ET คือมันช่วยรักษาข้อมูลที่สูญหายไประหว่างการทําให้บริสุทธิ์ อย่างไรก็ตาม สิ่งนี้จะมีประโยชน์ก็ต่อเมื่อการเตรียมตัวอย่าง กลยุทธ์การถ่ายภาพ และคําถามทางชีวภาพถูกออกแบบร่วมกันเป็นโครงการเดียวกัน

นักวิจัยสามารถ ปรึกษากับ Longlight ในโครงการโครงสร้าง ณ สถานที่ หลังจากอธิบายให้พวกเขาทราบถึงประเภทตัวอย่างที่จะใช้ ตําแหน่งเป้าหมาย ประเภทของโครงสร้างที่ต้องการบรรลุ และการวิเคราะห์ปลายน้ําที่จะใช้

คำถามที่ถามบ่อย

คําถามที่ 1. การถ่ายภาพด้วยอิเล็กตรอนแช่แข็ง (Cryo-ET)?

Cryo-ET เกี่ยวข้องกับการถ่ายภาพตัวอย่างชีวภาพหลายภาพในตู้กระจกจากมุมต่าง ๆ แล้วนําภาพนี้มาสร้างใหม่เป็นโทโมแกรม 3 มิติ ประโยชน์สําคัญอย่างหนึ่งคือมันรักษาข้อมูลโครงสร้างไว้ในสภาพแวดล้อมทางชีวภาพที่ใกล้เคียงกับพื้นเมือง

คําถามที่ 2 เงื่อนไขที่เหมาะสมสําหรับการใช้ Cryo-ET แทน cryo-EM แบบอนุภาคเดียวคืออะไร?

พิจารณา cryo-ET เมื่อตําแหน่งของเซลล์ การจัดเยื่อหุ้มเซลล์ เพื่อนโมเลกุล หรือสถาปัตยกรรมพื้นเมืองเป็นปัจจัยสําคัญต่อคําถามวิจัย เมื่ออนุภาคที่บริสุทธิ์หรือโครงสร้างโมเลกุลเฉลี่ยเป็นจุดสนใจ SPA มักจะเป็นแบบตรงไปตรงมามากกว่า

คําถามที่ 3. ควรใช้การบดแบบ cryo-FIB สําหรับตัวอย่างทั้งหมดของ Cryo-ET หรือไม่?

ไม่ สามารถถ่ายภาพตัวอย่างที่บางตามธรรมชาติได้โดยตรง ในบริเวณที่หนากว่าของเซลล์ อาจจําเป็นต้องทําให้บางลงเพื่อสร้างส่วนที่โปร่งใสของอิเล็กตรอนในเซลล์สําหรับการถ่ายภาพเอกซเรย์

คําถามที่ 4 อะไรที่ขาดหายไปใน Cryo-ET?

ขาดข้อมูล 3D จากช่วงมุมที่จํากัดซึ่งสามารถเก็บได้จากการเอียงซีรีส์ อาจทําให้เกิดความไม่สมมาตร หรือมีสิ่งรบกวนในการสร้างใหม่ ซึ่งต้องนํามาพิจารณาในการวิเคราะห์

คําถามที่ 5 จําเป็นต้องทําการเฉลี่ยซับโทโมแกรมสําหรับทุกโครงการที่ดําเนินการใน Cryo-ET หรือไม่?

ไม่ โทโมแกรมเพียงครั้งเดียวสามารถตอบคําถามเกี่ยวกับรูปร่างหรือการจัดระเบียบเชิงพื้นที่ได้อย่างเพียงพอ คุณค่าของการเฉลี่ยซับโทโมแกรมอยู่ที่ความเป็นไปได้ในการจัดแนวและเฉลี่ยสําเนาที่คล้ายกันของเป้าหมายหลายชุดเมื่อมีอยู่