ระบบถ่ายภาพชีววิทยาโมเลกุล: การเลือกแพลตฟอร์มที่เหมาะสมสําหรับเจลและบลอต

ระบบถ่ายภาพชีววิทยาระดับโมเลกุลให้ผลลัพธ์ดิจิทัลของเจลหรือเมมเบรนที่สามารถดู วัดปริมาณ เก็บรักษา และเปรียบเทียบได้ สามารถตั้งค่าให้สแกนเจลที่มีดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ เจลโปรตีนย้อม บล็อกตะวันตกเรืองแสงเคมี บล็อกเรืองแสง และตัวอย่างสี

ควรใช้ระบบที่พอดีกับการทดสอบ ไม่ใช่ในทางกลับกัน

ระบบถ่ายภาพชีววิทยาโมเลกุลทํางานอย่างไร?

ระบบถ่ายภาพมาตรฐานจะประกอบด้วยห้องที่ปิดแสง กล้อง เลนส์ ขั้นตอนตัวอย่าง แหล่งกําเนิดแสงที่ใช้กระตุ้นตามต้องการ ฟิลเตอร์ที่อนุญาตให้ผ่านแสงที่มีความถี่การแผ่รังสีตามที่กําหนด ซอฟต์แวร์สําหรับกล้องบันทึกภาพ และซอฟต์แวร์สําหรับวิเคราะห์ภาพ

ในกรณีของเจลกรดนิวคลีอิก เครื่องมือจะส่องแสง UV, สีน้ําเงิน หรือแสงที่เหมาะสมอื่น ๆ ลงบนคราบเรืองแสง แสงสีขาวมักถูกใช้สําหรับเจลโปรตีนที่มองเห็นได้ แสงที่ได้จากจุดแสงเคมีเรืองแสงแบบตะวันตกเป็นแสงที่ผลิตขึ้นเองและเกิดจากปฏิกิริยาเคมี ดังนั้นจึงจําเป็นต้องมีกล้องที่ไวต่อแสงและห้องถ่ายภาพมืด แต่ไม่จําเป็นต้องมีแสงเข้มสูงบนตัวอย่าง

แพลตฟอร์มแบบครบวงจรบางรุ่นมีความสามารถในการบันทึกข้อมูลด้วยเจล การถ่ายภาพด้วยสี การเรืองแสงเคมี และการเรืองแสงในตู้เดียวกัน ตัวอย่างเช่น ไบโอ-แรดมีระบบสําหรับถ่ายภาพเจลกรดนิวคลีอิกและโปรตีน รวมถึงก้อนเคมีเรืองแสง และระบบเหล่านี้สามารถขยายด้วยช่องแสงที่มองเห็นได้ ช่องแสงสีแดงไกล และช่องเรืองแสงใกล้อินฟราเรด

คุณสามารถเริ่มต้นด้วยตัวอย่างเสียงที่คุณรัน

จุดเริ่มต้นแรกคือบนโต๊ะทดลอง ไม่ใช่บนแผ่นสเปค!

สําหรับห้องปฏิบัติการสอนที่เน้นเจลอากาโรส อาจเป็นเพียงประเภทเดียวที่จําเป็น เช่น การถ่ายภาพรังสียูวี แสงสีน้ําเงิน และแสงขาว ห้องปฏิบัติการวิจัยโปรตีนที่แม่นยําต้องการการเรืองแสงเคมีที่ละเอียดอ่อนและช่องเรืองแสงหลายช่อง

Thermo Fisher แบ่งระบบการแสดงผลออกเป็นสองประเภท คือระบบที่ให้การแสดงผลอย่างง่าย และระบบที่ให้การวิเคราะห์ซอฟต์แวร์ รวมถึงการถ่ายภาพแบบ Western blot แบบเคมีเรืองแสงและฟลูออเรสเซนต์หลายช่องสัญญาณ ขอเตือนความจํา: ระบบเอกสารเจลไม่จําเป็นต้องเป็นเครื่องมือระดับหนึ่งของเครื่องถ่ายภาพโมเลกุลแบบมัลติโหมด

จับคู่แหล่งกระตุ้นและตัวกรองให้ตรงกับสี

สีย้อมฟลูออเรสเซนต์แต่ละชนิดมีช่วงความยาวคลื่นที่เหมาะสมที่สุดสําหรับการส่องสว่างและการปล่อยแสง ระบบถ่ายภาพต้องมีแหล่งกําเนิดแสงที่เหมาะสมเพื่อกระตุ้นสีย้อม และมีฟิลเตอร์ปล่อยแสงที่ช่วยให้โฟตอนที่ปล่อยแสง (ฟลูออเรสเซนซ์) เข้าถึงกล้องในขณะที่ปฏิเสธแสงที่ใช้กระตุ้นสีย้อม

ต่อไปนี้เป็นตัวอย่างของระบบที่สามารถประกอบด้วย:

• การส่องสว่างด้วยรังสียูวี
• การส่องสว่างด้วยแสงสีน้ําเงิน
• แสงสีขาวที่ส่งผ่าน
• แสงสะท้อนสีขาว
• การกระตุ้นด้วยแสงเรืองแสงที่มองเห็นได้
• การกระตุ้นด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์ใกล้อินฟราเรด

ไม่มีความสัมพันธ์ระหว่างจํานวนแหล่งกําเนิดแสงกับคุณภาพของมัน สิ่งสําคัญคือความยาวคลื่นและฟิลเตอร์ที่ติดตั้งเข้ากันได้กับสีย้อม แอนติบอดี และฉลากเรืองแสงที่ใช้ในห้องปฏิบัติการอยู่แล้วหรือไม่

ตรวจสอบรายการสารเคมีสําหรับห้องปฏิบัติการก่อนซื้อระบบเพื่อให้แน่ใจว่าระบบนั้นรองรับโดยแอปพลิเคชัน โปรดทราบว่าไม่ใช่สีย้อมเรืองแสงทุกชนิดจะสามารถจับภาพได้ เพราะระบบนี้ถูกเรียกว่า "เครื่องถ่ายภาพฟลูออเรสเซนต์"

เคมีเรืองแสงและเรืองแสงมีความคล้ายคลึงกันมาก

ในการบลอตแบบเคมีเรืองแสงตะวันตก แสงเกิดจากปฏิกิริยาเคมีเรืองแสงซึ่งมักอาศัยเอนไซม์แอนติบอดีและสารเรืองแสง สัญญาณจะเปลี่ยนแปลงตามเวลา – ควรเริ่มถ่ายภาพภายในระยะเวลาที่แนะนําสําหรับสารตั้งต้น

การบลอตแบบตะวันตกที่ทําโดยเรืองแสงต้องการแสงภายนอกของการกระตุ้น สามารถใช้ในการมัลติเพล็กซ์การทดลอง ทําให้สามารถตรวจจับเป้าหมายหลายจุดบนเมมเบรนเดียวกันผ่านช่องเรืองแสงที่แตกต่างกัน

เคมีเรืองแสงมักใช้สําหรับการตรวจจับที่ไวและสม่ําเสมอ เมื่อการมัลติเพล็กซ์หรือการจับสัญญาณที่เสถียร หรือการเปรียบเทียบเชิงปริมาณเป็นสิ่งสําคัญ มักเลือกใช้ฟลูออเรสเซนซ์ ไม่มีวิธีที่ดีที่สุดเพียงวิธีเดียว เพราะขึ้นอยู่กับข้อกําหนดของการทดสอบ ปริมาณเป้าหมาย แอนติบอดี ฉลากที่ใช้ และเป้าหมายการวิเคราะห์

หากห้องปฏิบัติการดําเนินการทดสอบทั้งสองอย่างเป็นประจํา ควรมั่นใจว่าระบบที่เสนอจะอนุญาตให้ดําเนินการทดสอบได้ทั้งแบบเดิมและโดยไม่ต้องมีการเปลี่ยนแปลงฮาร์ดแวร์ที่ซับซ้อน

เมื่อถ่ายภาพ ให้พิจารณาช่วงไดนามิกและความอิ่มตัวของสี

บางจุดอาจมีแถบที่แข็งแรงมาก และแถบอ่อนหลายแถบ แถบสัญญาณแรงอาจอิ่มตัวหากการเปิดรับแสงนานพอที่จะเห็นสัญญาณจาง ๆ

เมื่อมีแสงมากจนพิกเซลของกล้องไม่สามารถจับภาพได้อีกต่อไป หลังจากนั้น ความชัดเจนที่เห็นได้ของแถบที่แสดงจะยังคงอยู่ แต่ระดับความเข้มจะไม่สามารถนํามาเปรียบเทียบเชิงปริมาณได้

ช่วงไดนามิกคือช่วงของสัญญาณอ่อนถึงสัญญาณแรงที่ระบบภาพสามารถบันทึกไว้ในภาพเดียว ช่วงไดนามิกที่กว้างขึ้นช่วยให้บันทึกช่วงความถี่ที่อ่อนและเข้มข้นได้ง่ายขึ้นโดยไม่สูญเสียข้อมูลใด ๆ

บางแพลตฟอร์มถ่ายภาพสามารถตรวจจับพิกเซลอิ่มตัว แนะนําการเปิดรับแสงที่เหมาะสม หรือใช้การเปิดรับแสงหลายครั้ง พวกมันสามารถลดจํานวนการถ่ายภาพแบบลองผิดลองถูกได้ แต่ไม่ได้มีเจตนาให้เป็นตัวแทนของการออกแบบการทดลองที่ดี แม้ว่าตัวอย่างจะถูกโอเวอร์โหลด ก็ควรได้รับการแก้ไขในช่วงการทดสอบ และสัญญาณแอนติบอดีที่แรงเกินไปก็ควรได้รับการแก้ไขด้วย

ควรหลีกเลี่ยงการใช้การเปิดรับแสงอัตโนมัติ

การเปิดรับแสงอัตโนมัติมีประโยชน์หากมีหลายคนผลัดกันใช้เครื่องดนตรี หรือมีปัจจัยอื่นที่อาจทําให้วัดความแรงของสัญญาณได้ยาก

บางระบบจะได้ค่าการสัมผัสเริ่มต้นสั้น ๆ แล้วจึงเสนอค่าการสัมผัสโดยรวมจากข้อมูลนั้น แหล่งกําเนิดแสง โฟกัส และการตั้งค่าแอปพลิเคชันจะถูกเลือกโดยอัตโนมัติโดยผู้อื่น

สิ่งนี้อาจช่วยให้การถ่ายภาพเป็นประจํารวดเร็วขึ้น แต่โปรดตรวจสอบโดยผู้ปฏิบัติงาน ตรวจสอบว่า:

• หมายเหตุ: ความอิ่มตัวของแถบสําคัญควรระบุไว้
• แถบแสงอ่อน ๆ สามารถเห็นได้อยู่ด้านบนของพื้นหลัง
• ขอบเขตการมองเห็นทั้งหมดครอบคลุมโดยตัวอย่างทั้งหมด
• เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด จึงใช้โหมดการถ่ายภาพที่ถูกต้อง
• ใช้แผ่นกรองและถาดที่จําเป็น
• ต่อไปนี้เป็นการวิเคราะห์เชิงปริมาณและต้องการชุดการเปิดเผยข้อมูล:

การตั้งค่าอัตโนมัติเป็นจุดเริ่มต้นที่ดี แต่ไม่ใช่ข้ออ้างที่จะไม่ตรวจสอบภาพ

ตรวจสอบให้แน่ใจว่าความละเอียด ความไว และมุมมองถูกต้องทั้งหมด

ความละเอียดมีความสําคัญต่อภาพที่กล้องถ่าย แต่จํานวนเมกะพิกเซลไม่ใช่ตัวบ่งชี้คุณภาพของภาพกล้อง

นอกจากนี้ยังสําคัญที่จะมีระบบที่ใช้งานได้จริงซึ่งมีความไวเพียงพอ มีพื้นหลังต่ํา ออปติกติกดี มีความสม่ําเสมอ และมีมุมมองกว้างพอที่จะรองรับเจลหรือเมมเบรนที่ใช้ในห้องปฏิบัติการ

ถ้าสัญญาณเรืองแสงเคมีอ่อน จะต้องใช้กล้องที่ไวมาก ยิ่งระยะห่างระหว่างแถบความถี่มากเท่าไร ความละเอียดก็ยิ่งน้อยลงเท่านั้น ยิ่งระยะห่างระหว่างแถบความถี่น้อยและความละเอียดก็ยิ่งสําคัญ และยิ่งฟีเจอร์ในตัวอย่างที่ต้องแยกมีขนาดเล็กเท่าไร ความละเอียดก็ยิ่งต้องการมากขึ้น

วางถาดเจลแล็บขนาดใหญ่ที่สุด ถาดบลอต หรือถาดมัลติเจลบนจุดที่ถ่ายภาพก่อนซื้อ ถ้าเจลขนาดใหญ่ถูกตัดเป็นหลายภาพ จะเสียแรงและเปรียบเทียบจะยากขึ้น

ตรวจสอบให้แน่ใจว่าภาพถูกเก็บอย่างสม่ําเสมอ

แนะนําให้ถ่ายภาพภายใต้เงื่อนไขเดียวกันเมื่อเปรียบเทียบภาพ

เขียนโหมดการถ่ายภาพ ประเภทของแหล่งกําเนิดแสง ฟิลเตอร์ เวลาการรับแสง การแบ่งแยก โฟกัส ตําแหน่งตัวอย่าง การตั้งค่าการวิเคราะห์ พื้นหลัง และการแก้ไขพื้นหลังใด ๆ หากจําเป็น ให้นําโปรโตคอลที่บันทึกไว้กลับมาใช้ใหม่

ถ้าย้อมหรือย้อม ให้แน่ใจว่าเงื่อนไขเดียวกันสําหรับเจลกรดนิวคลีอิกและโปรตีน ควบคุมการโหลดตัวอย่างควบคุม ความเข้มข้นของแอนติบอดี เวลาของสารตั้งต้น และการจัดการเยื่อหุ้มในบล็อกตะวันตก

อิมเมเจอร์จะบันทึกได้เฉพาะตัวอย่างที่ใส่เข้าไปเท่านั้น มันไม่สามารถแก้ไขการถ่ายโอนที่ไม่สม่ําเสมอ การถ่ายทอดพื้นหลังมากเกินไป ช่องทางที่มากเกินไป หรือการขาดความจําเพาะของแอนติบอดีได้

ทดสอบซอฟต์แวร์วิเคราะห์

งานทั่วไปไม่ควรยากที่จะทําด้วยซอฟต์แวร์วิเคราะห์ภาพ และซอฟต์แวร์ไม่ควรบดบังผลลัพธ์

ฟังก์ชันที่น่าสนใจบางอย่างอาจได้แก่:

• การตรวจจับเลนและแถบความถี่
• การประมาณน้ําหนักโมเลกุล
• การลบพื้นหลัง
• การวัดความเข้มของแถบความถี่
• คําเตือนความอิ่มตัว
• การทําให้เป็นปกติ
• การแสดงผลแบบมัลติเพล็กซ์แชนแนล
• การใส่คําอธิบายภาพ
• การส่งออกข้อมูล
• เมื่อผู้ใช้หรือการทดลองถูกบันทึก

การวิเคราะห์ในตัวเป็นข้อได้เปรียบสําหรับงานประจํา และซอฟต์แวร์เดสก์ท็อปอาจเหมาะสมกว่าสําหรับการวิเคราะห์อย่างละเอียดรวมถึงการเตรียมตัวเลขสุดท้าย ตัวอย่างเช่น ระบบถ่ายภาพเทอร์โมฟิชเชอร์มีระบบเก็บข้อมูลและวิเคราะห์บนยาน รวมถึงเวิร์กโฟลว์ซอฟต์แวร์ภายนอก

เก็บไฟล์ภาพต้นฉบับไว้ให้นานที่สุดเท่าที่จะทําได้ การปรับภาพที่แสดงไม่ควรแทนที่ข้อมูลการได้มาแบบดิบ

ตรวจสอบให้แน่ใจว่าคุณได้ระมัดระวังและดําเนินการเพิ่มเติมเพื่อให้แน่ใจว่าตัวอย่างของคุณปลอดภัย

จึงสําคัญที่จะต้องมีการป้องกันที่เหมาะสม เนื่องจากแสงอัลตราไวโอเลตโดยตรงหรือสะท้อนจากอุปกรณ์ถ่ายภาพ UV อาจก่อให้เกิดความเสียหายต่อดวงตาและผิวหนัง การได้รับแสงสามารถลดลงได้โดยการปิดห้องถ่ายภาพซึ่งน้อยกว่ากล่องแสง UV แบบเปิด

ถ้าจะสกัดดีเอ็นเอจากเจล การใช้การกระตุ้นด้วยแสงสีน้ําเงินอาจเหมาะสมกับการย้อมด้วยกรดนิวคลีอิก การถ่ายภาพด้วยแสงขาวช่วยขจัดการใช้รังสียูวีในการดูคราบโปรตีนที่มองเห็นได้

ระบบนี้ควรออกแบบเพื่อป้องกันการปนเปื้อนจากตัวอย่างหนึ่งไปยังอีกตัวอย่างหนึ่ง ล้างถาดตัวอย่าง กําจัดคราบบัฟเฟอร์โดยเร็วที่สุด และปฏิบัติตามแนวทางของผู้ผลิตในการทําความสะอาดฟิลเตอร์ เลนส์ และพื้นผิวถ่ายภาพ

ตรวจสอบให้แน่ใจว่าระบบถูกตั้งค่าเป็นเครื่องมือแสง

เครื่องถ่ายภาพชีววิทยาโมเลกุลไม่สามารถทําความสะอาดได้แค่บางครั้ง

แหล่งกําเนิดแสงจะสึกหรอเมื่อเวลาผ่านไป ฟิลเตอร์อาจมีรอยขีดข่วน ถาดตัวอย่างอาจมีคราบและฝุ่นอาจส่งผลต่อคุณภาพของภาพ ห้องปฏิบัติการควรติดตามแสงสว่าง ตรวจสอบถาดและตัวกรอง สํารองข้อมูลโปรโตคอลการจัดหา อัปเดตซอฟต์แวร์อย่างรอบคอบ และรักษาเอกสารการบํารุงรักษา

ถ้าคุณภาพภาพไม่ดี ให้ทําขั้นตอนทั้งหมดดูว่ามีปัญหากับกล้องหรือส่วนอื่น ๆ ของสายงานหรือไม่ สาเหตุอาจมาจากสีย้อม ตัวอย่างหรือวัสดุรองพื้น การตั้งค่าการเปิดรับแสง แหล่งกําเนิดแสง หรือฟิลเตอร์

บทสรุป

แพลตฟอร์มที่มีประโยชน์ที่สุดไม่ใช่แพลตฟอร์มที่มีฟีเจอร์มากที่สุดเสมอไป มันคืออุปกรณ์ที่ให้แสงสว่างที่เหมาะสม ความไว ช่วงไดนามิก ซอฟต์แวร์ พื้นที่ถ่ายภาพ และกระบวนการทํางานที่ผู้ใช้คนอื่นสามารถทําซ้ําได้

การถ่ายภาพที่ดีเริ่มตั้งแต่ขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง เครื่องมือจะบันทึกการทดลอง แต่ถ้าการเตรียมการทดสอบทําอย่างรอบคอบและเก็บข้อมูลซ้ํา ๆ ภาพ (บันทึก) ก็จะมีความหมาย

คําถามที่พบบ่อย

คําถามที่ 1. ระบบถ่ายภาพชีววิทยาโมเลกุลสามารถจับภาพอะไรได้บ้าง?

มันสามารถจับเจลดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ เจลโปรตีน บล็อกตะวันตกเรืองแสง บล็อกตะวันตกเรืองแสง และเยื่อหุ้มสี ขึ้นอยู่กับการตั้งค่า

คําถามที่ 2 ความแตกต่างระหว่างระบบเอกสารเจลกับเครื่องถ่ายภาพ Western Blot คืออะไร?

ไม่เสมอไป ระบบเจลพื้นฐานอาจรองรับการถ่ายภาพด้วยแสง UV, แสงฟ้า และแสงขาวเท่านั้น และเครื่องถ่ายภาพ Western blot อาจต้องการการตรวจจับเรืองแสงเคมีหรือแสงเรืองแสงหลายช่องสัญญาณที่ไวต่อแสง

คําถามที่ 3. ทําไมช่วงไดนามิกถึงสําคัญ? ทําไมช่วงไดนามิกถึงสําคัญ?

ช่วงไดนามิกของสัญญาณที่กว้างจะช่วยให้สามารถจับสัญญาณที่อ่อนและแรงได้โดยไม่อิ่มตัวของสัญญาณที่แรงที่สุด โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการวิเคราะห์เชิงปริมาณ

คําถามที่ 4 การเปิดเผยอัตโนมัติสามารถเชื่อถือได้หรือไม่?

การกําหนดช่วงการสัมผัสเริ่มต้นอาจเป็นประโยชน์ ผู้ปฏิบัติงานควรสังเกตปัจจัยอื่น ๆ เช่น ความอิ่มตัว พื้นหลัง สัญญาณอ่อน และโหมดการถ่ายภาพ

คําถามที่ 5 โหมดถ่ายภาพแบบไหนดีที่สุด?

โหมดที่ใช้ขึ้นอยู่กับตัวอย่าง สี ฉลาก และวัตถุประสงค์การวิเคราะห์ แหล่งกําเนิดแสง ฟิลเตอร์ และการตั้งค่ากล้องขึ้นอยู่กับการทดสอบ