ระบบการแยกชิ้นส่วนดีเอ็นเอด้วยอัลตราโซนิก: อะไรที่ทําให้การเฉือนดีเอ็นเอสามารถทําซ้ําได้?

การทําลายดีเอ็นเอไม่ใช่เรื่องใหญ่

สิ่งสําคัญคือการแยกชิ้นส่วนออกเป็นการกระจายชิ้นส่วนที่มีประโยชน์และทําซ้ําได้ จากตัวอย่างหนึ่งไปยังอีกตัวอย่างหนึ่ง จากวันหนึ่งไปอีกวันหนึ่ง

ดังนั้น ความสามารถในการเฉือนดีเอ็นเอจีโนมจึงไม่ควรเป็นเกณฑ์เดียวที่ใช้ประเมินระบบการแตกแยกดีเอ็นเอด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง คําถามสําหรับห้องปฏิบัติการ NGS คือ ตัวอย่างสามารถกําหนดได้อย่างชัดเจนและวางไว้ในเครื่องมือวันนี้ สัปดาห์หน้า หรือในมือของห้องปฏิบัติการอื่น และยังสามารถนําไปสู่การเตรียมห้องสมุดได้โดยไม่ต้องคิดทบทวนกระบวนการทั้งหมด

แทนที่จะเป็นกระบวนการโซนิคแบบเดี่ยว การแยกเสียงแบบควบคุมเป็นส่วนหนึ่งของ Longlight การตัด DNA/RNA เวิร์กโฟลว์ ซึ่งออกแบบมาเพื่อการเตรียมตัวอย่าง NGS ความแตกต่างนี้มีประโยชน์เมื่อออกแบบเทคนิคที่ต้องปรับให้เหมาะกับงานแล็บประจําวัน

เริ่มต้นด้วยโปรไฟล์ Fragment เสมอ ไม่ใช่การตั้งค่าพลังงาน

เป้าหมายของการทดลองไม่ใช่การตั้งค่าเครื่องมือ

เป้าหมายคือประชากรดีเอ็นเอที่ถูกนําออกจากท่อ

การกําหนดสิ่งที่คาดหวังหลังจากเวิร์กโฟลว์ห้องสมุดเป็นจุดเริ่มต้นแรก และจากนั้นจึงย้อนกลับไปสู่โพรโทคอลเสียง การตั้งค่าที่สร้างการกระจายที่เป็นประโยชน์สําหรับอาร์เรย์หนึ่งของ DNA ไม่ควรถูกมองว่าเป็นโปรโตคอลสากลสําหรับอาร์เรย์อื่น ๆ

สิ่งนี้มีความสําคัญอย่างยิ่งในกรณีของการถ่ายโอนวิธีการ มันง่ายที่จะทําโปรแกรมโซนิเคชันซ้ําจากการทดลองก่อนหน้าและถือว่างานสําเร็จ ความเข้มข้นของตัวอย่าง ปริมาตรตัวอย่าง สภาพดีเอ็นเอ ประเภทของหลอด และประวัติการแปรรูป ล้วนเป็นส่วนหนึ่งของวิธีการในทางปฏิบัติ

ดังนั้นระบบจึงต้องได้รับการตรวจสอบรอบตัวอย่างจริง ไม่ใช่รอบตัวเลขที่น่าสนใจซึ่งแสดงบนหน้าจอมิเตอร์

ดีเอ็นเอมาพร้อมกับอดีตที่ผ่านมา

"ดีเอ็นเอจีโนม" ที่มีอยู่ในหลอดสองหลอดไม่จําเป็นต้องเป็นอินพุตที่เท่ากันเสมอไป

สามารถรวมดีเอ็นเอน้ําหนักโมเลกุลสูงจากการสกัดที่สะอาดได้ อีกคนหนึ่งอาจเคยผ่านกระบวนการจัดเก็บข้อมูล การจัดการหลายครั้ง หรือกระบวนการกรองข้อมูลก่อนเกิดการแตกแยก

นั่นสําคัญเพราะขั้นตอนตัดเฉือนเป็นขั้นตอนกลางในขั้นตอนที่ใหญ่กว่า

ห้องปฏิบัติการควรระบุตัวแปรที่สามารถควบคุมได้ (ปริมาตรตัวอย่าง ช่วงความเข้มข้นของดีเอ็นเอ ประเภทของภาชนะ สภาพอุณหภูมิ และขั้นตอนการจัดการ) ก่อนที่จะปรับแต่งโพรโตคอลการแยกชิ้นส่วนดีเอ็นเอด้วยอัลตราโซนิก หากไม่เป็นเช่นนั้น ข้อผิดพลาดอาจแสดงออกหลายขั้นตอนขึ้นไปในลักษณะปัญหาเครื่องมือ

ในเกือบทุกกรณีของอัลตราซาวด์แบบโฟกัส พลังงานจะถูกนําไปใช้กับเป้าหมาย

วิธีการอัลตราซาวด์แบบดั้งเดิมมักทําให้นักวิจัยเน้นไปที่ปริมาณอัลตราซาวด์ที่สร้างขึ้นเป็นหลัก คําถามอีกข้อเกี่ยวกับการอัลตราโซนิซึมแบบโฟกัสคือ: พลังงานเสียงนั้นไปไหน?

ระบบ BoFU ของ Longlight ไม่จําเป็นต้องใส่โพรบเข้าไปในตัวอย่างชีวภาพ แต่ต้องการแง่มุมของพลังงานเสียงที่โฟกัสภายในสื่อเสียง ใช้กระบวนการแบบไม่สัมผัสและควบคุมอุณหภูมิแบบบูรณาการ BoFU-100 เครื่องอัลตราโซนิกที่เน้น ถูกกล่าวว่าออกแบบมาเพื่อการเฉือน DNA, RNA และโครมาติน รวมถึงการแตกแยกจีโนม สําหรับ NGS

การจัดเรียงแบบปิดแบบไม่สัมผัสนี้สะดวกต่อการแตกตัวของดีเอ็นเอ เพราะตัวอย่างไม่จําเป็นต้องสัมผัสโดยตรงกับโพรบโซนิเคชัน นอกจากนี้ยังช่วยลดตัวแปรการสัมผัสตัวอย่างและการทําความสะอาดที่ควรจะถูกรวมอยู่ในโปรโตคอล

ไม่จําเป็นต้องเป็น "อัลตราซาวด์มากขึ้น"

เป็นการส่งอัลตราซาวด์ที่ควบคุมได้ดีขึ้น

อุณหภูมิเป็นส่วนหนึ่งของวิธี Fragmentation!

ความร้อนเป็นปัจจัยที่มองข้ามได้ง่ายเพราะมันไม่ใช่ตัวแปรแยกในไฟล์ลําดับสุดท้าย

อย่างไรก็ตาม สภาพความร้อนในระหว่างการโซนิคเป็นส่วนหนึ่งของสภาพแวดล้อมการประมวลผลตัวอย่าง ถ้าประวัติอุณหภูมิแตกต่างกันในแต่ละรอบ โปรโตคอลจะถูกทําซ้ําแตกต่างกัน

นี่คือเหตุผลที่สําคัญที่ต้องคิดถึงการจัดการอุณหภูมิตั้งแต่ต้นกระบวนการออกแบบก่อนเรื่องอะคูสติก ไม่ใช่แค่เครื่องมือชิ้นหนึ่ง

การออกแบบเครื่องอัลตราโซนิเคเตอร์แบบเน้นของ Longlight รวมถึงการประมวลผลตัวอย่างที่อุณหภูมิต่ําและอุณหภูมิคงที่ รวมถึงการเซ็นเซอร์แบบบูรณาการเพื่อควบคุมความร้อนที่เกิดขึ้นระหว่างการบําบัดด้วยเครื่องอัลตราโซนิเคเตอร์

สําหรับการพัฒนาวิธีการ นั่นคือการบันทึกเงื่อนไขที่เกี่ยวข้องกับอุณหภูมิ อย่างจริงจังเท่ากับโปรแกรมโซนิคเอง

"Reproducible" หมายถึงอะไรเมื่อมีอัตราการส่งข้อมูล?

ถ้าใช้หลอดเดียวได้ราบรื่นจะยุ่งยากถ้ามีตัวอย่าง 20 หรือ 40 ชิ้นก่อนอาหารกลางวัน

ดังนั้นในจุดนั้นมันจะเป็นปัญหาเรื่องความเร็วมากกว่า

ตัวอย่างสามารถเก็บไว้ได้นานหลายช่วงเวลาก่อนการแปรรูป ผู้ปฏิบัติงานสามารถตั้งค่าหลายครั้งได้ อาจมีความแตกต่างระหว่างประเภทของตัวอย่าง กระบวนการทํางานเช่นนี้ ซึ่งมีงานมือซ้ํา ๆ จํานวนมาก อาจทําให้เกิดความแปรปรวนได้ แม้ว่าเทคโนโลยีเสียงจะเสถียรก็ตาม

Longlight's เครื่องอัลตราโซนิเตอร์โฟกัส BoFU-800 สามารถประมวลผลตัวอย่างได้ระหว่าง 1-8 ตัวอย่าง พร้อมเงื่อนไขที่สามารถปรับแต่งได้ และตั้งค่าแบบชุดที่สามารถนําไปใช้ได้หากมีการประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกัน

พื้นที่ BoFU-1600 เครื่องอัลตราโซนิกที่เน้น ออกแบบมาเพื่อจัดการตัวอย่างในขนาดล็อตขนาดใหญ่ มีตําแหน่งตัวอย่าง 16 ตําแหน่ง และสามารถประมวลผลแยกชิ้นหรือเป็นล็อตได้

คําถามสําคัญเกี่ยวกับการจัดซื้อคือ "ระบบใดมีตําแหน่งมากที่สุด?"

นั่นคือ "มีตัวอย่างกี่ตัวอย่างที่ถูกประมวลผลร่วมกันจริง ๆ และตัวอย่างเหล่านั้นต้องใช้โปรโตคอลที่แตกต่างกันบ่อยแค่ไหน?"

ดูมากกว่าขนาดชิ้นส่วนเฉลี่ย

ตัวอย่างดีเอ็นเอที่ประสบความสําเร็จไม่ได้ทําให้กระบวนการแตกแยกดีเอ็นเอประสบความสําเร็จ

การตรวจสอบไม่ควรเป็นการรันที่สะอาดที่สุด แต่ควรจะทําซ้ําและทําชุดข้อมูลพร้อมกัน นักวิทยาศาสตร์ควรพิจารณาว่าการกระจายของชิ้นส่วนยังคงเหมาะสมหรือไม่ มีส่วนท้ายที่ผิดปกติหรือไม่ หรือการกระจายของชิ้นส่วนจะกว้างขึ้น และการเตรียมห้องสมุดปลายน้ําทํางานได้อย่างสม่ําเสมอหรือไม่

นี่คือจุดที่ห้องปฏิบัติการควรตัดสินใจว่าจะตรวจสอบคุณภาพของชิ้นส่วนอย่างไรเป็นประจํา

QC จะดําเนินการเฉพาะในช่วงพัฒนาวิธีการเท่านั้น และไม่ได้ใช้ในกระบวนการประมวลผลตามปกติ การเปลี่ยนแปลงเล็ก ๆ น้อย ๆ อาจสะสมก่อนที่ใครจะตรวจพบได้

เจตนาไม่ใช่เพื่อแสดงความสามารถของเครื่องโซนิเคเตอร์ในการแยก DNA เพียงครั้งเดียว

แนวคิดคือการสร้างกระบวนการที่สามารถทําซ้ําได้

เลือกเครื่องดนตรีรอบโต๊ะ ไม่ใช่รอบโบรชัวร์

แต่ละห้องแล็บจะมีข้อจํากัดของตัวเอง

กลุ่มวิจัยขนาดเล็กที่ทําตัวอย่าง DNA, RNA หรือโครมาตินเพียงเล็กน้อย บางครั้งอาจชื่นชมการทํางานแบบบูรณาการขนาดเล็ก ห้องปฏิบัติการลําดับที่ทําตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกันอาจสนใจการประมวลผลแบบขนานมากกว่า อาจต้องการอัตราการส่งข้อมูลที่มากขึ้นและการตั้งค่าที่ทําซ้ําได้/ติดตามได้ระหว่างผู้ปฏิบัติงานภายในศูนย์หลัก

ด้วยเหตุนี้ จึงไม่สามารถเลือกระบบที่เหมาะสมได้เพียงแค่อิงจากเทคโนโลยีอะคูสติก

ตามที่ลองไลท์กล่าวไว้ คําถามที่พบบ่อยเกี่ยวกับเครื่องอัลตราโซนิเตอร์โฟกัสแทนที่จะเลือกเฉพาะสเปค ให้พิจารณาปัจจัยต่าง ๆ เช่น การควบคุมพลังงานเสียง ความสม่ําเสมอของขนาดชิ้นส่วน อัตราการส่งข้อมูล ความเข้ากันได้ของหลอด การบํารุงรักษา งบประมาณบริการ และงบประมาณห้องปฏิบัติการ

การตรวจสอบความถูกต้องขั้นสุดท้าย

ก่อนที่จะนําระบบการแยกชิ้นส่วนดีเอ็นเอด้วยอัลตราโซนิกมาใช้ในโปรโตคอลการเตรียม NGS ปกติของคุณ ควรตั้งคําถามเชิงปฏิบัติบางประการ

สามารถได้โปรไฟล์ชิ้นส่วนที่ต้องการในห้องปฏิบัติการจากตัวอย่างมากกว่าหนึ่งตัวอย่างหรือไม่? มีเงื่อนไขการป้อนข้อมูลที่ระบุไว้หรือไม่? อุณหภูมิถูกควบคุมหรือไม่? รูปแบบของหลอด/ตัวอย่างเหมาะสมกับโปรโตคอลหรือไม่? เป็นไปได้ไหมที่จะเพิ่มอัตราการส่งข้อมูลโดยไม่ต้องเพิ่มการเปลี่ยนแปลงด้วยมือที่ไม่จําเป็น?

ถ้าคําตอบของคําถามเหล่านั้นชัดเจน ขั้นตอนโซนิคของการสร้างจีโนมที่แตกกระจายก็ไม่ใช่แค่ขั้นตอนโซนิเคชันเดี่ยวอีกต่อไป แต่เป็นสิ่งที่ควรจะเป็น: การส่งต่ออย่างควบคุมไปยังการเตรียมห้องสมุด

คำถามที่ถามบ่อย

คําถามที่ 1. ระบบการแตกตัวของดีเอ็นเอด้วยอัลตราโซนิกคืออะไร?

มันตัด DNA ออกเป็นชิ้นเล็ก ๆ ด้วยพลังงานเสียงที่ควบคุมได้ เพื่อใช้ในกระบวนการทํางาน รวมถึงการเตรียมห้องสมุด NGS พลังงานนี้สามารถส่งผ่านโดยระบบที่มีโฟกัสผ่านสื่อเสียงโดยไม่ต้องสัมผัสตัวอย่างด้วยโพรบ

คําถามที่ 2 การแตกตัวของ DNA NGS สามารถทําได้ด้วยการอัลตราซาวด์แบบโฟกัสหรือไม่?

ใช่ ตามรายชื่อที่เผยแพร่โดย Longlight การแตกสลายของจีโนมสําหรับ NGS เป็นหนึ่งในแอปพลิเคชันของระบบอัลตราโซนิเคเตอร์โฟกัส BoFU ของ Longlight ยังมีเงื่อนไขบางอย่างที่ต้องปรับแต่งให้เหมาะสมกับตัวอย่างและการไหลของแต่ละกรณี

คําถามที่ 3. กําลังอัลตราโซนิกที่มากขึ้นหมายถึงดีกว่าหรือไม่?

ไม่ เป้าหมายไม่ใช่แค่การได้พลังงานเสียงสูงสุด แต่เป็นการกระจายเศษเสียงที่สามารถทําซ้ําได้ ซึ่งสามารถนําไปใช้ในการประมวลผลต่อไป การตั้งค่าควรขึ้นอยู่กับสภาพตัวอย่างและโปรโตคอล

คําถามที่ 4 ทําไมการควบคุมอุณหภูมิระหว่างการเจียร DNA จึงสําคัญ?

ลักษณะของกระบวนการอัลตราโซนิกคือจะเกิดความร้อนขึ้น ทําให้อุณหภูมิกลายเป็นพารามิเตอร์ในการประมวลผล สภาวะความร้อนที่ควบคุมได้มีความสําคัญเพื่อรักษาการวิ่งที่ใกล้เคียงกันเมื่อทําซ้ําด้วยวิธีการแบ่งชิ้นส่วนเดียวกัน

คําถามที่ 5 ควรเลือกระบบ throughput แบบไหน?

เริ่มต้นด้วยการพิจารณาจํานวนตัวอย่างที่มักจะถูกประมวลผลในแต่ละครั้ง และว่าตัวอย่างเหล่านั้นจําเป็นต้องดําเนินการภายใต้เงื่อนไขเดียวกันหรือแตกต่างกันหรือไม่ BoFU-800 รองรับการประมวลผลตัวอย่าง 1–8 ครั้ง และ BoFU-1600 มีตําแหน่งตัวอย่าง 16 ตําแหน่งสําหรับเวิร์กโฟลว์ขนาดใหญ่