การตัดโครมาติน: วิธีสร้างเวิร์กโฟลว์ ChIP ที่ทําซ้ําได้

การตัดโครมาตินเป็นหนึ่งในขั้นตอนที่ไวที่สุดในโปรโตคอล ChIP เศษชิ้นส่วนที่มีขนาดใหญ่เกินไปอาจทําให้ความละเอียดลดลงและเกิดการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันได้ไม่ดีการเฉือนที่ความเข้มสูงเกินไปอาจนําไปสู่ความเสียหายของเอพิโทป ดีเอ็นเอ–โปรตีน และวัสดุที่สามารถกู้คืนได้

ไม่มีโปรแกรมใดที่จะใช้ได้กับทุกตัวอย่างการตอบสนองของโครมาตินต่อพลังงานอัลตราโซนิกจะแตกต่างกันไปตามชนิดของเซลล์ การตรึง วัสดุเริ่มต้น และขึ้นอยู่กับประสิทธิภาพของการสลายโครมาตินและปริมาตรของตัวอย่างกระบวนการเตรียมทั้งหมดควรถูกควบคุมเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้ ไม่ใช่แค่เปลี่ยนเวลาการอัลตราซาวด์เท่านั้น

อะไรคือ การตัด ของโครมาติน?

ก่อนการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน การตัดโครมาตินจะทําลายโครมาตินที่เชื่อมโยงกันให้กลายเป็นชิ้นส่วนโปรตีนดีเอ็นเอขนาดเล็กลงจากนั้นสามารถใช้แอนติบอดีเพื่อเพิ่มความเข้มข้นของโครมาตินที่เกี่ยวข้องกับปัจจัยการถอดรหัสเฉพาะ ฮิสโตน หรือการดัดแปลงฮิสโตน

หลังจากการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน การเชื่อมโยงข้ามจะถูกย้อนกลับ ดีเอ็นเอจะถูกทําให้บริสุทธิ์ และบริเวณที่อุดมสมบูรณ์จะถูกวิเคราะห์ด้วย qPCR หรือการถอดรหัส Longlight's โซลูชัน ChIP-seq ให้ความช่วยเหลือในการศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับดีเอ็นเอและตําแหน่งควบคุมจีโนมทั่วทั้งจีโนม

การเฉือนโครมาตินแตกต่างจากการแตกแยกดีเอ็นเอบริสุทธิ์ เนื่องจากนิวคลีโอโซม โปรตีนที่เกี่ยวข้อง และลิงก์ข้ามฟอร์มาลดีไฮด์เปลี่ยนแปลงการเข้าถึงดีเอ็นเอและคุณสมบัติทางกล

ทําไม Fragment ถึงเป็น ขนาด สําคัญไหม?

ชิ้นส่วนขนาดใหญ่จะลดความละเอียดของตําแหน่งลง เพราะดีเอ็นเอที่กู้คืนได้อาจยาวกว่าตําแหน่งจับโปรตีนมากชิ้นส่วนเหล่านี้อาจสร้างพื้นหลังเมื่อมีบริเวณรอบ ๆ ที่ไม่เฉพาะเจาะจงแต่ยังเชื่อมต่อกันทางกายภาพ

อย่าสมมติว่าชิ้นงานสั้นมากจะดีกว่าเสมอไปการประมวลผลมากเกินไปอาจทําให้สูญเสียผลผลิตภูมิคุ้มกันตกผลึก สูญเสียอีพิโทปที่ไวต่อสาร หรือโปรไฟล์ไลบรารีไม่เหมาะสม

ขนาดชิ้นส่วนที่เหมาะสมจะแตกต่างกันไปตามโปรโตคอล ChIP เป้าหมายทางชีวภาพ แอนติบอดีที่ใช้ และการวิเคราะห์ในขั้นตอนถัดไปดังนั้น ห้องปฏิบัติการควรกําหนดการแจกแจงที่ยอมรับได้สําหรับการทดสอบของตนเอง ไม่ใช่แค่ขนาดเฉลี่ยสากล

แล้วเรื่อง การตัด ด้วยการเชื่อมโยงข้าม?

การเชื่อมโยงข้ามจะรักษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับดีเอ็นเอไว้ ในขณะที่การเชื่อมโยงข้ามที่รุนแรงเกินไปอาจทําให้โครมาตินแตกตัวได้ยากและอาจบดบังเอพิโทปของแอนติบอดีปฏิสัมพันธ์ที่อ่อนหรือชั่วคราวอาจสูญเสียไปเนื่องจากการตรึงไม่เพียงพอ

เวลาการตรึงจะแตกต่างกันไปตามชนิดของตัวอย่าง ความเข้มข้นของสารตั้งต้น ความหนาแน่นของเซลล์ และโปรตีนเป้าหมายการดับต้องสม่ําเสมอเช่นกัน เนื่องจากพฤติกรรมของตัวอย่างจะเปลี่ยนไปเมื่อมีการเชื่อมโยงข้ามเพิ่มเติม

หากตัวอย่างยังคงต้านทานการเฉือนแม้จะเพิ่มพลังงานเสียงแล้ว ก็จะไม่แก้ไขปัญหาพื้นฐานเงื่อนไขการเชื่อมโยงข้ามและการดับต้องพิจารณาก่อนที่จะนําโปรแกรมที่เข้มงวดขึ้นมาใช้

ทําไมต้องเลือกการป้อนข้อมูลจากเซลล์ และ การไลซิสสําคัญหรือไม่?

การมีเซลล์มากเกินไปในปริมาณเล็กน้อยอาจทําให้เกิดโครมาตินหนาและเหนียวซึ่งเกิดการเฉือนอย่างไม่สม่ําเสมอวัสดุเริ่มต้นที่น้อยเกินไปอาจเพิ่มการสูญเสียการจับและทําให้ประเมินคุณภาพของโครมาตินได้ยากขึ้น

จํานวนเซลล์ระหว่างการทดลองควรถูกปรับให้เท่ากันตัวอย่างเนื้อเยื่อต้องการความระมัดระวังเป็นพิเศษ เนื่องจากมีความเสี่ยงสูงที่จะเกิดการไลเซตที่ไม่สม่ําเสมอเนื่องจากวัสดุนอกเซลล์ ความแตกต่างของโครงสร้าง และการแยกตัวที่ไม่สมบูรณ์

ก่อนการโซนิเคชัน การปล่อยนิวเคลียสและโครมาตินอย่างมีประสิทธิภาพเป็นสิ่งสําคัญการสลายตัวที่ไม่สมบูรณ์อาจทําให้เกิดนิวเคลียสที่ไม่แตกสลายหรือกลุ่มเซลล์ที่สัมผัสกับพลังงานในรูปแบบที่แตกต่างจากส่วนอื่นของตัวอย่าง

โฟกัสอย่างไร การอัลตราโซนิก ช่วยปรับปรุงการควบคุมได้ไหม?

เครื่องโซนิเตอร์โพรบใช้เมื่อพลังงานถูกส่งตรงไปยังตัวอย่างความแปรปรวนและศักยภาพในการปนเปื้อนอาจเกิดจากตําแหน่งของโพรบ ความลึกของการจุ่ม และเทคนิคของผู้ปฏิบัติงาน

การอัลตราโซนิกแบบโฟกัสใช้ในการส่งพลังงานเสียงผ่านสื่อเชื่อมต่อเข้าสู่ภาชนะเก็บตัวอย่างที่ปิดส่งผลให้เกิดสภาพแวดล้อมการประมวลผลที่ควบคุมได้มากขึ้นและไม่สัมผัส

พื้นที่ เครื่องอัลตราโซนิเตอร์โฟกัส BoFU-100 ให้การเจียร DNA, RNA และโครมาตินที่ควบคุมอุณหภูมิได้ The ระบบ BoFU-1600 มีตัวเลือกสําหรับกระบวนการทํางานในห้องปฏิบัติการหลายช่องทางเมื่อประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่าง

พารามิเตอร์ใดที่ควรได้รับการปรับแต่ง?

ความเข้มของเสียง รอบการทํางาน ระยะเวลาการรักษา จํานวนรอบการหยุดพัก ปริมาตรตัวอย่าง และอุณหภูมิตัวอย่าง เป็นตัวแปรสําคัญ

เปลี่ยนตัวแปรหลักทีละตัวในระหว่างการปรับให้เหมาะสมเบื้องต้นเมื่อความเข้ม ระยะเวลา และ/หรือความเข้มข้นของเซลล์ถูกปรับเปลี่ยนพร้อมกัน อาจเป็นเรื่องยากที่จะระบุว่าผลลัพธ์ดีขึ้นหรือแย่ลงจากการเปลี่ยนแปลงใดอย่างหนึ่ง

ทดสอบเมทริกซ์เงื่อนไขขนาดเล็กรอบจุดเริ่มต้นที่เหมาะสมและเปรียบเทียบการกระจายชิ้นส่วนและการกู้คืนดีเอ็นเอ

- ไม่ใช่การรักษาที่แรงที่สุดที่ทําให้ดีเอ็นเอสั้นที่สุด!

หลังจากเลือกโปรแกรมแล้ว ให้บันทึกโปรแกรมที่มีอินพุตการวัดเซลล์ บัฟเฟอร์ หลอด และปริมาตรตัวอย่างหากไม่มีเงื่อนไขเหล่านี้ พารามิเตอร์โซนิเคชันจะไม่สามารถจําลองได้อย่างน่าเชื่อถือ

ทําไมถึงเป็นแบบนั้น สําคัญ ว่าตัวอย่างต้องเก็บให้เย็น?

การบําบัดด้วยอัลตราโซนิกมีผลความร้อนร่วมด้วย และโครมาตินอาจไวต่อความร้อนความเสียหายของโปรตีน การสูญเสียการรับรู้แอนติบอดี และความแปรปรวนที่เพิ่มขึ้นอาจเป็นปัจจัยของความร้อน

การเย็นตลอดทั้งรอบควรเท่ากัน (แม้ในช่วงพักระหว่างรอบ)ความเร็วในการเคลื่อนที่ของท่อระหว่างถังน้ําแข็งกับเครื่องมือไม่ควรส่งผลต่ออุณหภูมิของตัวอย่าง

การตัด คุณภาพ เช็ค: อย่างไร?

หลังจากตัดแล้ว ให้นําตัวอย่าง aliquot เป็นตัวแทนย้อนกลับลิงก์ข้าม ทําความสะอาดดีเอ็นเอ และประเมินการกระจายขนาดชิ้นส่วนทั้งหมดด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอากาโรสหรือเครื่องวิเคราะห์ชิ้นส่วนอัตโนมัติที่เหมาะสม

อย่าประเมินโครมาตินที่เชื่อมโยงกันแบบไม่ได้รับการบําบัดเหมือนกับว่าเป็นดีเอ็นเอที่ผ่านการทําให้บริสุทธิ์ขนาดที่เห็นได้อาจทําให้เข้าใจผิดได้เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงการเคลื่อนที่ที่เกิดจากโปรตีนและการเชื่อมต่อข้าม

วัสดุส่วนใหญ่ควรอยู่ในช่วงที่ห้องปฏิบัติการยอมรับ โดยมีประชากรวัสดุน้ําหนักโมเลกุลสูงน้อยหรือแทบไม่มีเลยปริมาณดีเอ็นเอที่กู้คืนได้ควรถูกวัดด้วย เพราะโปรไฟล์ที่ดีไม่มีคุณค่าหากดีเอ็นเอส่วนใหญ่สูญหายไป

ทําไมถึงมี ไม่สอดคล้องกัน การเฉือนของโครมาติน?

สาเหตุเหล่านี้เกิดจากการตรึงที่เปลี่ยนแปลง จํานวนเซลล์ที่ไม่แม่นยํา การสลายตัวไม่สมบูรณ์ ปริมาตรตัวอย่างที่แตกต่างกัน ประเภทของหลอดที่แตกต่างกัน และการเคลื่อนตัวของอุณหภูมิ

ฟองหรือฟองอากาศเป็นปัญหาที่ส่งผลต่อการเชื่อมต่อเสียงดังนั้น หลอดตัวอย่างต้องถูกเติม ปิดฝา และวางในลักษณะเดียวกันสําหรับการพัฒนาวิธีการ หลอดจากประเภทที่ผ่านการตรวจสอบความถูกต้องหรือล็อตที่ผ่านการตรวจสอบจะเป็นที่นิยม

หากมีความแตกต่างระหว่างผลลัพธ์จากชุดข้อมูล อาจบ่งชี้ว่ามีผลต่อตําแหน่งตัวอย่าง หรือเวลาการเตรียมตัวอย่างอาจไม่สอดคล้องกันบันทึกการรันแบบง่าย ๆ สามารถช่วยให้ดูว่ามีความแตกต่างกันเกี่ยวกับชีววิทยา ขั้นตอน หรือเครื่องมือหรือไม่

ควรปรับแต่งประเภทตัวอย่างใหม่อย่างไร?

เริ่มต้นด้วยการยึดติดขนาดเล็กและวัสดุอะคูสติกที่ใช้วัสดุที่เป็นตัวแทนของการทดลองจริงอย่าใช้ตัวอย่างที่มีค่าหรือไม่สามารถทดแทนได้ในการทดสอบครั้งแรก

ประเมินการกระจายของชิ้นส่วน การกู้คืนดีเอ็นเอ และประสิทธิภาพการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันหลังจากการตัดเฉือน สามารถประเมินความเหมาะสมของโครมาตินสําหรับ ChIP โดยใช้แอนติบอดีควบคุมบวกและตําแหน่งเป้าหมายที่ทราบ

เมื่อปรับแต่งได้แล้ว ให้ตั้งค่าพารามิเตอร์สําคัญใน SOP สําหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับอัลตราซาวด์โฟกัสสําหรับการเตรียมโครมาติน โปรดดูที่ Longlight's หน้าสมัคร ChIP

บทสรุป

ไม่ใช่แค่เรื่องพลังอัลตราโซนิกในการทําให้โครมาตินเฉือนได้อย่างน่าเชื่อถือเท่านั้นองค์ประกอบต่าง ๆ เช่น การตรึง การป้อนข้อมูลของเซลล์ การสลายเซลล์ รูปทรงของตัวอย่าง และสภาพเสียงและอุณหภูมิ ต้องเข้ากันได้

วิธีที่เหมาะสมที่สุดจะให้การกระจายชิ้นส่วนที่เหมาะสมและรักษาประสิทธิภาพการตกตะกอนทางภูมิคุ้มกันและการกู้คืนวัสดุแต่ละห้องปฏิบัติการสามารถติดต่อ Longlight ผ่านหน้าติดต่อเพื่อขอข้อมูลเกี่ยวกับประเภทและชุดตัวอย่าง รวมถึงกระบวนการทํางาน ChIP ที่ต้องการใช้ เพื่อสนับสนุนอุปกรณ์และแอปพลิเคชัน

คําถามที่พบบ่อย

Q1. ทําไมจึงจําเป็นต้องมีการตัดโครมาติน?

มันจะทําลายโครมาตินที่เชื่อมโยงข้ามกันให้เป็นชิ้นส่วนเล็ก ๆ สําหรับ IP การใช้ชิ้นส่วนที่มีขนาดควบคุมจะเพิ่มความละเอียดของ ChIP-qPCR และ ChIP-seq

Q2. จะเกิดอะไรขึ้นถ้าโครมาตินถูกเฉือนน้อยเกินไป?

ชิ้นงานขนาดใหญ่มากอาจทําให้ความละเอียดลดลงและเพิ่มพื้นหลังที่ไม่จําเพาะควรพิจารณาประเมินการตรึง การสลาย และสภาพเสียงใหม่ก่อนที่จะยืดเวลาการรักษาโดยอัตโนมัติ

Q3. เป็นไปได้ไหมที่จะเฉือนโครมาตินมากเกินไป?

ใช่ถ้าใช้การรักษามากเกินไป การฟื้นตัวจะบกพร่อง หรืออีพิโทปโปรตีนและคอมเพล็กซ์ดีเอ็นเอ-โปรตีนจะได้รับความเสียหายไม่ใช่ความคิดที่ดีเสมอไปที่จะใช้ชิ้นส่วนสั้น ๆ

Q4. โครมาตินต้องเก็บไว้ในน้ําแข็งระหว่างการอัลตราชมหรือไม่?

ใช่กระบวนการที่อุณหภูมิต่ํามีความเสถียร ซึ่งช่วยลดความเสียหายต่อตัวอย่างและโปรตีนที่เกิดจากความร้อนอุณหภูมิควรคงที่ระหว่างตัวอย่างและชุด

Q5. มีโครมาติน-เธอเพียงตัวเดียวหรือไม่aโปรแกรมวงแหวนที่ใช้ได้กับเซลล์ทุกประเภท?

โดยปกติแล้วจะไม่เป็นเช่นนั้นความแตกต่างระหว่างโครงสร้างเซลล์ ความหนาแน่นของโครมาติน การตอบสนองต่อการตรึง และความเข้มข้นของตัวอย่างมีอยู่ และตัวอย่างใหม่ควรได้รับการปรับแต่งในระดับจํากัด