Cryo-EM ความละเอียดสูงสําหรับเป้าหมายต่ํากว่า 100 kDa: แนวทางใหม่ ผลลัพธ์ที่แท้จริง

Cryo-EM ความละเอียดสูงได้กลายเป็นวิธีการประจําในชีววิทยาโครงสร้าง แต่เกือบ 75% ของยีนที่เข้ารหัสโปรตีนของมนุษย์ผลิตโปรตีนที่ต่ํากว่า 50 kDa ซึ่งเป็นส่วนที่ยังคงมีจํานวนน้อยอย่างมีนัยสําคัญในธนาคารข้อมูลกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (EMDB) ช่องว่างนี้ไม่ได้เกิดจากการขาดความสําคัญ แต่เป็นข้อจํากัดทางกายภาพพื้นฐาน: อนุภาคขนาดเล็กจะสร้างสัญญาณที่อ่อนแอกว่าโดยเนื้อแท้เมื่อเทียบกับสัญญาณรบกวนรอบข้าง

'Di-Gembodies' ที่มีข้อจํากัดโควาเลนต์ช่วยให้โซลูชันโครงสร้างคู่ขนาน

โดย cryo-EM | ชีววิทยาเคมีธรรมชาติ

ในช่วงหลายปีที่ผ่านมา เราโชคดีที่ได้เห็นการใช้งานและนวัตกรรมที่ใช้งานได้จริง รวมถึงนั่งร้านทางวิศวกรรม เครื่องมือแข็งที่ปรับให้เหมาะสมกับ AI เครื่องมือขั้นสูง และเวิร์กโฟลว์ที่มีประสิทธิภาพและประสิทธิผลมากขึ้น ในที่นี้ เราจะพูดถึงความท้าทายในการกําหนดเป้าหมายต่ํากว่า 100 kDa แนวทางใหม่ล่าสุดเพื่อจัดการกับความท้าทายเหล่านี้ และวิธีการเหล่านี้เริ่มเป็นส่วนหนึ่งของแนวทางปฏิบัติมาตรฐานได้อย่างไร

ความท้าทายของโปรตีนขนาดเล็ก

อนุภาคเดี่ยว cryo-EM ทํางานได้ดีที่สุดสําหรับคอมเพล็กซ์ขนาดใหญ่ สัญญาณมีมากมายและทําให้กระบวนการจัดตําแหน่งและการสร้างแบบจําลองสามมิติใหม่ง่ายขึ้น อย่างไรก็ตาม สําหรับเป้าหมายขนาดเล็ก มีความท้าทายต่อเนื่องสองประการ:

•ลดอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน: คอมเพล็กซ์ขนาดเล็กจะกระจายอิเล็กตรอนน้อยลง ดังนั้นเป้าหมายเหล่านี้จึงมีความท้าทายมากขึ้นในการแยกสัญญาณจริงออกจากเสียงรบกวนรอบข้าง

• ส่วนประกอบโครงสร้างไม่เพียงพอ: โปรตีนขนาดเล็กไม่มีคุณสมบัติเด่น ด้วยเหตุนี้ อัลกอริทึมสําหรับ cryo-EM จึงมีปัญหากับการเลือกอนุภาคที่เหมาะสมและการวางแนวที่เหมาะสม

ความท้าทายเหล่านี้อธิบายถึงข้อเท็จจริงที่ว่าน้อยกว่า 4% ของโครงสร้างที่สะสมซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของ EMDB นั้นต่ํากว่า 100 kDa แม้ว่าโปรตีนขนาดเล็กจะมีมากทั้งในสิ่งมีชีวิตยูคาริโอตและโปรคาริโอต

เทคนิคที่ช่วยให้ Cryo-EM สามารถจัดการกับเป้าหมายโปรตีนขนาดเล็กได้

มีการสํารวจแนวทางแยกต่างหากหลายวิธีในการแก้ปัญหาคอขวด SNR ต่ํา วิธีการส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการรักษาโครงสร้างดั้งเดิมของโปรตีนเป้าหมายขนาดเล็ก แนวทางหลักคือการเพิ่มขนาดที่มีประสิทธิภาพของโปรตีนเป้าหมายและคอมเพล็กซ์

นั่งร้านเสริมมวล: ธรรมดาและเรียบง่าย

โปรตีนที่จับและนั่งร้านจากโปรตีนช่วยเพิ่มมวลอนุภาคที่ช่วยเพิ่มการจัดตําแหน่ง การออกแบบนั่งร้านที่โดดเด่นสามแบบที่พิสูจน์ความสําเร็จมีดังต่อไปนี้:

• Di-Gembodies (Nature Chemical Biology, 2025): การมีข้อ จํากัด การมีเพศสัมพันธ์ ไดเมอร์นาโนบอดี้โควาเลนต์ และการจับส่วนต่อประสานทางวิศวกรรม วิธีนี้ช่วยให้สามารถกําหนดโครงสร้างโปรตีนนั่งร้านได้แทบทุกชนิด รวมถึงความละเอียดล่าสุดของโครงสร้าง cryo-EM ไลโซไซม์ไข่ไก่ขาว 14 kDa ซึ่งเป็นโครงสร้าง cryo-EM ที่เล็กที่สุดจนถึงปัจจุบัน สถาบันโรซาลินด์แฟรงคลิน มหาวิทยาลัยอ็อกซ์ฟอร์ด และ Diamond Light Source ได้พัฒนาแนวทางแบบแยกส่วนนี้ และไม่จําเป็นต้องมีการเพิ่มประสิทธิภาพใหม่ที่ใช้เวลานานสําหรับเป้าหมายโปรตีนใหม่

'Di-Gembodies' ที่มีข้อจํากัดโควาเลนต์ช่วยให้โซลูชันโครงสร้างคู่ขนาน

โดย cryo-EM | ชีววิทยาเคมีธรรมชาติ

• DARPin-Apoferritin Scaffold (IUCrJ, 2025): โปรตีนนั่งร้านที่ออกแบบโดยอะโปเฟอร์ริตินแบบสมมาตร แปดเหลี่ยม และ 1 เมกะดาลตัน ช่วยให้สามารถเบียดเบียนตัวอย่างและความละเอียดใกล้เคียงและย่อยอะตอมของ cryo-EM ได้ (บรรลุการปรับเปลี่ยนความแข็งและการจัดตําแหน่งของโปรตีนเพิ่มขึ้น 70%)

IUCr) นั่งร้าน DARPin–apoferritin ขนาดใหญ่ทั่วไปและแบบแยกส่วน

ช่วยให้มองเห็นโปรตีนขนาดเล็กโดย cryo-EM

• Disulfide-Rigid Fabconstr, (Nature Communications, 2025): การใช้วิศวกรรมโมเลกุลแบบวนซ้ํา การออกแบบนี้ช่วยให้มีความละเอียด 2.3–2.5 Å และให้โครงสร้าง cryo-EM ความละเอียดสูง

Fabs ที่มีข้อจํากัดของไดซัลไฟด์เอาชนะข้อจํากัดด้านขนาดเป้าหมายสําหรับ

cryoEM อนุภาคเดี่ยวความละเอียดสูง | การสื่อสารธรรมชาติ

เครื่องมือวัดขั้นสูงและการประมวลผลข้อมูล

ห้องปฏิบัติการบางแห่งไม่จําเป็นต้องมีนั่งร้าน สําหรับโปรตีนเมมเบรนที่มีน้ําหนักโมเลกุลต่ําและทํางานได้ดีส่วนใหญ่ (น้อยกว่า 100 kDa) การกําหนดโครงสร้างโมเลกุลเป็นกิจวัตรประจําวัน เนื่องจากความก้าวหน้าในเครื่องมือวัดและวิธีการประมวลผลข้อมูล

•การกําหนดเป้าหมายกําลังขยายที่สูงขึ้นน้ําแข็งบาง ๆ กําลังขยายที่เพิ่มขึ้นโดยกําหนดเป้าหมายไปยังส่วนน้ําแข็งบาง ๆ สามารถเพิ่มการสุ่มตัวอย่างและลดสัญญาณรบกวนของข้อมูลได้ตามลําดับ

•การปรับปรุงการจัดตําแหน่งโดยใช้การจับคู่เทมเพลต 2 มิติ การจัดตําแหน่งของคอมเพล็กซ์ kDa ต่ํา (ต่ํากว่า 50 kDa) ได้รับการปรับปรุงโดยใช้การจับคู่เทมเพลต 2 มิติกับโครงสร้างที่ได้รับการแก้ไขอย่างดีก่อนหน้านี้ ขีดจํากัด kDa ขั้นต่ําสําหรับ cryo-EM อนุภาคเดี่ยวคาดว่าจะอยู่ที่ประมาณ 38 kDa

•แผ่นเฟสโวลต้าสําหรับการปรับปรุงคอนทราสต์ แผ่นเฟสที่เพิ่มความคมชัดของเฟสของความถี่เชิงพื้นที่ต่ําสามารถอํานวยความสะดวกในการสังเกตอนุภาคที่มีขนาดเล็กกว่าขีดจํากัดการเลี้ยวเบนได้ สเตรปตาวิดิน tetramer พื้นผิว (52 kDa) ได้รับการแก้ไขเป็นแผ่นเฟส 3.2 Å (Volta) และด้วยเหตุนี้จึงแสดงให้เห็นถึงคุณค่าของแผ่นเฟสสําหรับชิ้นงานขนาดเล็ก

เทคโนโลยี Longlight รองรับโครงการ Cryo-EM ต่ํากว่า 100 kDa อย่างไร

ที่ Longlight Technology เราเข้าใจดีว่า ไครโอ-อีเอ็ม เป็นเครื่องมือ ไม่ใช่จุดจบในตัวเอง โดยเฉพาะอย่างยิ่งสําหรับเป้าหมายโปรตีนขนาดเล็กที่ตัวอย่างมีจํากัดและเส้นทางสู่โครงสร้างไม่ค่อยเป็นเส้นตรง บริการของเราสร้างขึ้นจากหลักการสามประการที่สอดคล้องกับความต้องการของนักวิจัยที่จัดการกับเป้าหมายมวลต่ําที่ท้าทาย:

• เวิร์กโฟลว์ที่โปร่งใสและเป็นขั้นเป็นตอน: ทุกโครงการเริ่มต้นด้วยการประเมินความเหมาะสมของตัวอย่างผ่านการตรวจสอบคราบเชิงลบเพื่อตรวจสอบความเป็นเนื้อเดียวกัน สิ่งนี้ช่วยประหยัดทั้งเวลาและทรัพยากรอันมีค่า

• การเข้าถึงเครื่องมือวัดระดับไฮเอนด์: ที่โรงงานของเรา เราสนับสนุนแอปพลิเคชัน cryo-EM และ cryo-ET โดยใช้ Glacios 2 (ระบบ cryo-EM ขนาด 200 kV ที่ปรับให้เหมาะสมสําหรับการวิเคราะห์อนุภาคเดี่ยวเป็นประจํา) และ Titan Krios G4 (แพลตฟอร์มเรือธง 300 kV ที่ออกแบบมาเพื่อปลดปล่อยศักยภาพของทั้งความเสถียรและความละเอียดสูงสุด) สําหรับการคัดกรองและประเมินผลเบื้องต้น เรายังจัดเตรียม Talos L120C G2 และเปิดโอกาสให้ทีมประเมินพฤติกรรมของตัวอย่างโดยไม่ต้องใช้ทรัพยากรมากเกินไป

•ความโปร่งใสของข้อมูลที่สมบูรณ์: เราจัดเตรียมภาพยนตร์ cryo-EM ดิบทั้งหมดไฟล์ทั้งหมดจากไฟล์ที่ประมวลผลและยังไม่ได้ประมวลผลแผนที่ความหนาแน่น 3 มิติขั้นสุดท้ายและความละเอียดที่สอดคล้องกันและแบบจําลองพิกัดอะตอมทั้งหมด (ถ้ามี) และรายงานการตรวจสอบข้ามทั้งหมด ความพร้อมใช้งานของข้อมูลเต็มรูปแบบช่วยให้มั่นใจได้ว่าการตีความของคุณจะไม่ถูกจํากัดด้วยสิ่งที่ผู้ให้บริการเลือกที่จะแบ่งปัน

Longlight Technology ก่อตั้งขึ้นในปี 2015 โดยมุ่งเน้นไปที่การวินิจฉัยระดับโมเลกุลและชีววิทยาโครงสร้าง โดยนําเสนอไม่เพียง แต่บริการ cryo-EM เท่านั้น แต่ยังรวมถึงเครื่องมือในห้องปฏิบัติการที่มีความแม่นยําและวัสดุสิ้นเปลืองจีโนม เช่น ระบบอัลตราโซนิกที่โฟกัสและชุดสกัดกรดนิวคลีอิก ความเชี่ยวชาญด้านการผลิตของเราช่วยให้เราสามารถสนับสนุนนักวิจัยตั้งแต่การเตรียมตัวอย่างไปจนถึงการส่งมอบโครงสร้างขั้นสุดท้าย ซึ่งเป็นแนวทางแบบบูรณาการที่มีคุณค่าอย่างยิ่งสําหรับโครงการโปรตีนขนาดเล็กที่ความแม่นยําในการจัดการตัวอย่างเป็นสิ่งสําคัญ

บทสรุป

Cryo-EM ความละเอียดสูงสําหรับเป้าหมายที่ต่ํากว่า 100 kDa ได้เปลี่ยนจากความท้าทายในพรมแดนไปสู่ปัญหาที่แก้ไขได้ ไม่ว่าจะผ่านนั่งร้านเสริมมวล แอนติบอดีชิ้นส่วนที่มีข้อจํากัดของไดซัลไฟด์ ระบบแข็งที่ออกแบบโดย AI หรือเพียงแค่การรวบรวมข้อมูลที่ปรับให้เหมาะสมบนเครื่องมือที่ทันสมัย เมื่อตลาด cryo-EM ทั่วโลกขยายตัวและผู้ให้บริการอย่าง Longlight Technology ทําให้เครื่องมือเหล่านี้เข้าถึงได้มากขึ้นในที่สุดชีววิทยาโครงสร้างก็ตามทันความเป็นจริงที่ว่าโปรตีนขนาดเล็กไม่ใช่อุปกรณ์ต่อพ่วง แต่เป็นส่วนใหญ่

คําถามที่พบบ่อย

Q1: ขีดจํากัดขนาดขั้นต่ําสําหรับ Cryo-EM ความละเอียดสูงในปัจจุบันคือเท่าใด

ด้วยนั่งร้านที่ปรับให้เหมาะสม (เช่น Di-Gembodies, Trimbody) การรวบรวมข้อมูลจะมีประสิทธิภาพถึง ~14-20 kDa เครื่องมือ 300 kV ที่ทันสมัยสามารถแก้ปัญหาโปรตีนได้สูงถึง 50-70 kDa และไม่มีนั่งร้าน

Q2: นั่งร้านจําเป็นสําหรับโครงสร้างที่มีปริมาตรต่ํากว่า 100 kDa ทั้งหมดหรือไม่?

ไม่ โปรตีนที่ละลายน้ําได้คุณภาพสูง> 50 kDa สามารถแก้ไขได้โดยไม่ต้องใช้นั่งร้าน SNR หรือโปรตีนที่ไม่ดี< 50 kDa คือช่วงที่นั่งร้านมีประโยชน์มากที่สุด

Q3: ปริมาณตัวอย่างที่ต้องการใน Cryo-EM ต่ํากว่า 100 kDa คืออะไร?

สําหรับคราบลบ: ~100 μL ที่ ~1 g/L สําหรับการวิเคราะห์อนุภาคเดี่ยวความละเอียดสูง จําเป็นต้องใช้ปริมาณตัวอย่างในช่วงเดียวกันในตอนเริ่มต้น แต่การเพิ่มประสิทธิภาพกริดอาจจําเป็นต้องใช้วัสดุเพิ่มเติม ปริมาณการใช้ตัวอย่างมีอยู่ในเวิร์กโฟลว์ของ Longlight Technology

Q4: ความละเอียดที่คาดหวังในกรณีที่เป้าหมาย 50 kDa ที่ไม่มีนั่งร้านคืออะไร?

การเลือกเครื่องมือมีผลต่อการรวบรวมข้อมูล ตัวอย่างเช่น Titan Krios G4 หรือ Glacios 2 ความละเอียดสามารถอยู่ระหว่าง 3.0 Å ถึง 4.5 Å ช่วง sub-50 kDa ที่ปราศจากนั่งร้านเป็นสิ่งที่ท้าทาย ดังนั้นการเพิ่มมวลจึงเป็นทางออกที่ต้องการ

Q5: ฉันสามารถมีนั่งร้านที่ออกแบบโดย Longlight Technology ได้หรือไม่?

เรามุ่งเน้นไปที่การรวบรวมและประเมินข้อมูลและการประมวลผลข้อมูลที่โปร่งใส โดยเฉพาะสําหรับวิศวกรรมนั่งร้าน เช่น นาโนบอดี้ หรือ DARPin เราจะสนับสนุนข้อเสนอของลูกค้าหรือทํางานร่วมกับพันธมิตรที่โดดเด่น

อ้างอิง:

Yi, G., Mamalis, D., Ye, M. และคณะ 'Di-Gembodies' ที่มีข้อจํากัดโควาเลนต์ช่วยให้สามารถแก้ปัญหาโครงสร้างแบบขนานได้ด้วย cryo-EM แนทเคมีชีวภาพ 22, 69–76 (2026).

Kung, JE, Johnson, MC, Tegunov, D. และคณะ Fabs ที่มีข้อจํากัดของไดซัลไฟด์เอาชนะข้อจํากัดด้านขนาดเป้าหมายสําหรับ cryoEM อนุภาคเดี่ยวความละเอียดสูง นัทคอมมิวนิสต์ 16 (2025).

Trimbody พร้อมโครงนั่งร้านที่ออกแบบโดย AI แบบแข็งช่วยให้สามารถกําหนดโครงสร้าง cryo-EM ความละเอียดของอะตอมของโปรตีนขนาดเล็กได้ นัทคอมมิวนิสต์ (2026).

นั่งร้าน DARPin-apoferritin ขนาดใหญ่ทั่วไปและแบบแยกส่วนช่วยให้มองเห็นโปรตีนขนาดเล็กโดย cryo-EM ไอยูซีอาร์เจ (2025).