การตรวจสอบการทํางานของ GPCR: วิธีพิสูจน์โปรตีนบริสุทธิ์ของคุณยังคง "มีชีวิตอยู่"

หลังจากทุ่มเทความพยายามอย่างมากในการแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์ของโปรตีนเมมเบรน GPCR นักวิจัยต้องเผชิญกับคําถามสําคัญ: ตัวรับที่บริสุทธิ์ยังคงทํางานอยู่หรือไม่? สําหรับตัวรับโปรตีนคู่ G (GPCR) ซึ่งขึ้นชื่อว่าเปราะบางและซับซ้อนในโครงสร้าง การได้รับแถบโปรตีนบนเจลนั้นไม่เพียงพอ การตรวจสอบการทํางานเป็นข้อพิสูจน์สําคัญว่า GPCR ที่บริสุทธิ์ของคุณยังคงมีฤทธิ์ทางชีวภาพอยู่ บทความนี้จะตรวจสอบว่านักวิทยาศาสตร์ตรวจสอบ "ชีวิต" ในโปรตีนเมมเบรนบริสุทธิ์เพื่อยืนยันความพร้อมสําหรับการวิเคราะห์โครงสร้างหรือการพัฒนายาอย่างไร

ความสําคัญของการตรวจสอบการทํางานสําหรับ GPCR

GPCR เป็นโปรตีนส่งสัญญาณหลายสถานะ พวกเขาสามารถดํารงอยู่ในสถานะโครงสร้างต่างๆ (สถานะไม่ใช้งานใช้งานและสถานะกลางที่แตกต่างกัน) ผงซักฟอกในระหว่างการแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์ของโปรตีนเมมเบรน GPCR สามารถขจัดไขมันดั้งเดิม ซึ่งอาจทําให้ตัวรับไม่เสถียร หรือทําให้ตัวรับอยู่ในรูปแบบที่ไม่ได้ใช้งาน การตรวจสอบการทํางานสองส่วนจะกล่าวถึงสิ่งต่อไปนี้เป็นหลัก:

• GPCR ที่แยกได้สามารถจับลิแกนด์ได้หรือไม่?

• GPCR ที่แยกได้สามารถมีเพศสัมพันธ์กับ G-protein ได้หรือไม่ และ/หรือสามารถเปลี่ยนแปลงโครงสร้างได้หรือไม่?

ในกรณีที่ไม่มีการตรวจสอบเหล่านี้ การเตรียม GPCR ไม่ว่าจะให้ผลผลิตสูงแค่ไหน จะไม่เพียงพอสําหรับ cryo-EM การตกผลึก หรือเภสัชวิทยาเชิงกลไกใดๆ

ตัวอย่างทางประวัติศาสตร์และร่วมสมัย

มีตัวอย่างสําคัญสองตัวอย่างที่การตรวจสอบความถูกต้องของ GPCR ที่บริสุทธิ์ได้รับความสนใจอย่างมาก:

พ.ศ. 2539 – Kobilka และคณะ (Gether และคณะ) – แสดงให้เห็นโดยการใช้ตัวเร่งปฏิกิริยาเรืองแสงแบบใหม่ว่า GPCR ที่บริสุทธิ์ ตัวรับ β2-adrenergic สามารถรักษาการจับลิแกนด์และการกระตุ้น G-protein หลังจากรวมอยู่ในไลโปโซม นี่เป็นตัวอย่างแรกที่กําหนดเกณฑ์มาตรฐานสําหรับการตรวจสอบการทํางานของ GPCR หลังจากการทําให้บริสุทธิ์

2021 – Kato, HE และคณะ (ธรรมชาติ) – แสดงภาพ cryo-EM ความละเอียดสูงหลายภาพของตัวรับ μ-opioid ในสถานะใช้งานที่แตกต่างกัน และตัวรับ μ-opioid ได้รับการทําให้บริสุทธิ์และตรวจสอบการทํางานโดยการทดสอบนาโนบอดี้ GTPγS และ ELISA การศึกษาของพวกเขาแสดงให้เห็นว่าการตรวจสอบการทํางานของตัวรับมีความสําคัญและสัมพันธ์กับการศึกษา cryo-EM ความละเอียดสูง

การศึกษาเหล่านี้ตอกย้ําว่าการทดสอบการทํางานอย่างเข้มงวดนั้นแยกออกจากการแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์ของโปรตีนเมมเบรน GPCR ที่ประสบความสําเร็จไม่ได้

วิธีการหลักในการพิสูจน์ GPCR ของคุณคือ "มีชีวิตอยู่"

ด้านล่างนี้คือเทคนิคการตรวจสอบการทํางานที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุด โดยแต่ละเทคนิคจะกล่าวถึงแง่มุมที่แตกต่างกันของกิจกรรม GPCR

1. การทดสอบการจับกัมมันตภาพรังสีลิแกนด์ (ทั้งแบบคลาสสิกและเชิงปริมาณ)

• หลักการ: เมื่อ GPCRs บริสุทธิ์ถูกบ่มด้วยลิแกนด์กัมมันตภาพรังสี (agonist/antagonist) จะเกิดอะไรขึ้น?

• สิ่งที่พิสูจน์ได้: การเข้าเล่มจะบอกเราว่ากระเป๋าพับได้หรือไม่และสามารถเข้าถึงกระเป๋าได้หรือไม่

•การอ่านค่าทั่วไป: Kd, Bmax

• ข้อจํากัด: หากไม่มีลิแกนด์เฉพาะสถานะ เราจะไม่สามารถรู้อะไรเกี่ยวกับสถานะที่ไม่ได้ใช้งาน/ใช้งานของ GPCR

2. การผูกมัด GTPγS (การทดสอบการกระตุ้นโปรตีน G โดยตรง)

• หลักการ: GPCR ถูกทําให้บริสุทธิ์และรวมอยู่ในถุงไขมัน/นาโนดิสก์พร้อมกับโปรตีน G เฮเทอโรไตรเมอริก จากนั้นจึงเพิ่มนิวคลีโอไทด์ที่ไม่สามารถไฮโดรไลซ์ได้ [35S]GTPγS GPCR ที่ใช้งานอยู่จะจับ GTPγS และ G โปรตีน

• สิ่งที่พิสูจน์ได้: โปรตีน G ที่ใช้งานอยู่หมายความว่า GPCR จับคู่หูส่งสัญญาณแรกของวิถี ดังนั้น GPCR จึงเปิดใช้งานขั้นตอนแรกของน้ําตกการส่งสัญญาณ

• ดีที่สุดสําหรับ: เหมาะสําหรับการสํารวจกลไกที่อยู่นอกเหนือการจับลิแกนด์

3. เซ็นเซอร์โครงสร้างที่ใช้ NanoBRET และ FRET

• หลักการ: หนึ่งใน GPCR ถูกติดแท็กด้วยฟลูออโรฟอร์ของผู้บริจาค และลิแกนด์หรือไบโอเซนเซอร์ขนาดเล็กที่ซึมผ่านได้ของเมมเบรน (เช่น นาโนบอดี้) ที่ทําหน้าที่เป็นตัวรับ การเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง GPCR จะมาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงความใกล้ชิดของคู่ผู้บริจาค/ตัวรับ และสัญญาณ BRET/FRET ที่เกิดขึ้นหลังจากการเพิ่มตัวเร่งปฏิกิริยา

•สิ่งที่พิสูจน์: การทดสอบนี้สามารถตรวจจับการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของ GPCR ระหว่างสถานะที่ไม่ได้ใช้งานและสถานะที่ใช้งานอยู่แบบเรียลไทม์

•ข้อได้เปรียบ: การทดสอบ BRET / FRET ดําเนินการในผงซักฟอกและมีปริมาณงานสูง

4. การปรับสภาพเป็นไลโปโซมหรือนาโนดิสก์

• หลักการคืออะไร? GPCRs ถูกรวมเข้ากับ Nanodiscs หรือ liposomes ที่มีเยื่อหุ้มไลโปโซมสองชั้น เยื่อหุ้มสองชั้นที่มีโปรตีนไลโปโซมอลจีอยู่ในสถานการณ์ที่ปราศจากเซลล์

• แสดงอะไร? สภาพแวดล้อมของไขมันเป็นสิ่งจําเป็นสําหรับการทํางานของ GPCR

5. แอนติบอดีจําเพาะโครงสร้างหรือการจับนาโนบอดี้

• หลักการ: สําหรับ GPCR ให้ใช้นาโนบอดี้หรือแอนติบอดีเฉพาะโครงสร้าง เช่น การใช้ Nb80 สําหรับ β2AR ในสถานะใช้งานหรือไม่ใช้งานของ GPCR

• แสดงให้เห็นอะไร? ตัวรับจะถูกจับในสถานะการทํางานที่ใช้งานหรือไม่ใช้งาน

• เหตุใดสิ่งนี้จึงสําคัญ นี่เป็นสิ่งสําคัญเมื่อทํา cryo-EM กับโครงสร้างเดียว

การตรวจสอบความถูกต้องของฟังก์ชันในกระบวนการ GPCR

บริการการแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์ของโปรตีนเมมเบรน GPCR ควรเสนอการตรวจสอบการทํางานเป็นมาตรฐานสําหรับการควบคุมคุณภาพ ซึ่งประกอบด้วยสิ่งต่อไปนี้:

ขั้นตอนที่ 1 - การกําหนดขอบเขตและการออกแบบ: กําหนดจุดสิ้นสุดที่ใช้งานได้ (เช่น การผูกมัด การกระตุ้นโปรตีน G โครงสร้าง ฯลฯ ) ถูกสร้างขึ้น

ขั้นตอนที่ 2 - การแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์ GPCR แสดงร่วมกับส่วนประกอบที่ทําให้เสถียร

ขั้นตอนที่ 3 - การประเมินคุณภาพ SDS-PAGE, SEC, แมสสเปกโตรเมตรี

ขั้นตอนที่ 4 - การประเมินการทํางาน การทดสอบการติดฉลากรังสีและ GTPγS, FRET เป็นต้น

ขั้นตอนที่ 5 – การใช้ปลายน้ํา: การเตรียม Cryo-EM หรือการคัดกรองยาหากเป็นไปตามเกณฑ์การทํางาน

เทคโนโลยี Longlight นํามาซึ่งการตรวจสอบความถูกต้องของ GPCR ที่ใช้งานได้

ข้อเสนอเทคโนโลยี Longlight บริการวิจัยและพัฒนาโปรตีนเมมเบรนอย่างเต็มรูปแบบ ด้วยการตรวจสอบการทํางานแบบบูรณาการ การพัฒนาแพลตฟอร์ม Membrane Protein มุ่งเน้นไปที่เป้าหมาย GPCR ที่ท้าทาย

ประโยชน์บางประการคือ:

• ขอบเขตเต็มรูปแบบ: ความเชี่ยวชาญในการแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์ของโปรตีนเมมเบรน GPCR และการศึกษาการทํางาน

• SBDD ใช้ได้: ตัวอย่างที่ผ่านการตรวจสอบความถูกต้องของโครงสร้างจะถูกเตรียมไว้สําหรับ cryo-EM/X-Ray

• ทั้งหมด: การกําหนดขอบเขต การแสดงออก การทําให้บริสุทธิ์ cryo-EM และข้อมูลทั้งหมดรวมอยู่ด้วย

•ชีววิทยาโครงสร้างที่เกี่ยวข้อง: การตรวจสอบการทํางานขับเคลื่อนกริด 2 มิติและข้อมูล 3 มิติที่แม่นยําที่เกี่ยวข้องกับการสร้างใหม่

พวกเขาทําอะไร:

• การกําหนดขอบเขตและการออกแบบ: กําหนดเป้าหมายและการรักษาเสถียรภาพของโครงสร้าง

• การแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์: เป็นไปตามเกณฑ์คุณภาพตามเป้าหมาย

•ตัวอย่างและข้อมูลสําหรับ Cryo-EM: Grid และ Vitrification

•การสร้างใหม่และการจัดส่ง: แบบจําลองโครงสร้างสําหรับการออกแบบยาตามโครงสร้าง

*หมายเหตุ: บริการทั้งหมดมีไว้สําหรับการวิจัยเท่านั้น*

ปฏิบัติ Takeaways สําหรับ Rผู้ค้นหา

เมื่อคุณกําหนดเกณฑ์สําหรับโครงการการแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์ของโปรตีนเมมเบรน GPCR ให้พิจารณาสิ่งต่อไปนี้:

• อย่าข้ามการตรวจสอบการทํางาน การขาดกิจกรรมการทํางานไม่ได้รับประกันว่าตัวรับจะไม่ทํางาน

•ออกแบบการทดสอบของคุณโดยคํานึงถึงเป้าหมายสุดท้ายเช่นการจับลิแกนด์เป็นสิ่งจําเป็นสําหรับการทําแผนที่ epitope GTPγS จําเป็นสําหรับการส่งสัญญาณเซลลูลาร์ และโพรบโครงสร้างสําหรับ cryo-EM

• การปรับสภาพไขมันอาจมีความสําคัญ GPCR มีความต้องการที่แตกต่างกันสําหรับพื้นเมือง เช่น ไขมันสําหรับกิจกรรมการทํางาน

• การควบคุมเชิงบวกและเชิงลบเป็นสิ่งจําเป็น การตรวจสอบการทํางานของการทดสอบสามารถทําได้ด้วยตัวเร่งปฏิกิริยาและตัวเร่งปฏิกิริยาผกผันที่รู้จัก

บทสรุป.

การแสดงให้เห็นว่า GPCR ที่บริสุทธิ์นั้นใช้งานได้ไม่ใช่ทางเลือกเพิ่มเติม เป็นวิธีเดียวที่จะเชื่อมโยงการแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์ของโปรตีนเมมเบรน GPCR กับข้อมูลทางชีวภาพหรือโครงสร้างที่มีคุณค่า เมื่อรวมกับเทคนิคใหม่ๆ สามารถใช้วิธีการแบบคลาสสิก (nanoBRET, conformation specific nanobodies) (การจับกัมมันตภาพรังสี, GTPγS) เพื่อตรวจสอบตัวอย่างได้อย่างมั่นใจ ผสานรวมกับ GPCR ที่ใช้งานได้ แพลตฟอร์มที่รวมเข้าด้วยกันของ Longlight Technology ได้รับการออกแบบมาเพื่อตอบสนองความต้องการนี้และสนับสนุนขั้นตอนสําคัญของการตรวจสอบความถูกต้องสําหรับกระบวนการปลายน้ํา โปรดจําไว้ว่า GPCR ที่ใช้งานได้เป็นพื้นฐานสําหรับการค้นพบยาที่เชื่อถือได้และชีววิทยาโครงสร้าง

รับใบเสนอราคาฟรี | ติดต่อ Longlight Technology สําหรับการแสดงออก GPCR แบบกําหนดเอง การทําให้บริสุทธิ์ และบริการตรวจสอบการทํางาน

คําถามที่พบบ่อย

ไตรมาสที่ 1 เหตุใดการตรวจสอบการทํางานจึงจําเป็นหลังจากการทําให้บริสุทธิ์ของ GPCR

ตอบ: การตรวจสอบการทํางานเป็นสิ่งสําคัญในการพิจารณาว่าตัวรับสามารถมีเพศสัมพันธ์กับโปรตีน G และการจับลิแกนด์ได้หรือไม่ ไม่ใช่แค่ตรวจสอบว่ามีรอยพับโครงสร้างหรือไม่

ไตรมาสที่ 2 การดําเนินการ SDS-PAGE เท่านั้นเพื่อตรวจสอบว่า GPCR ของฉันทํางานได้หรือไม่

ตอบ: ไม่ SDS-PAGE ไม่ใช่วิธีการตรวจสอบการทํางาน ตรวจสอบเฉพาะความบริสุทธิ์ของ GPCR และน้ําหนักโมเลกุลเท่านั้น

ไตรมาสที่ 3 วิธีที่เร็วที่สุดในการทดสอบ GPCR ที่บริสุทธิ์คืออะไร?

ตอบ: วิธีการที่รวดเร็วและเชิงปริมาณคือการทดสอบการจับตัวกัมมันตภาพรังสีและใช้กันอย่างแพร่หลายในการทดสอบการพับตัวรับ

ไตรมาสที่ 4 GPCR ที่บริสุทธิ์จะต้องถูกสร้างขึ้นใหม่เป็นไขมันเสมอหรือไม่?

ตอบ: ไม่ มี GPCR จํานวนมากที่ต้องใช้นาโนดิสก์หรือไลโปโซมเป็นอย่างน้อยเพื่อให้ทํางานได้อย่างสมบูรณ์ แต่ DGM หรือระบบที่ใช้ผงซักฟอกบางตัวทําให้ GPCR ทํางานได้

ไตรมาสที่ 5 วิธีใดที่แสดงการกระตุ้น G Protein โดยตรง?

ตอบ: ลิแกนด์ที่จับกับตัวรับในระบบที่สร้างขึ้นใหม่และการกระตุ้นโปรตีน G แสดงในการทดสอบการจับ GTPγS