ตัวรับโปรตีน G Coupled Receptor: จากการส่งสัญญาณเซลล์สู่การค้นพบยา

ตัวรับโปรตีน G ที่เชื่อมโยงกัน หรือเรียกสั้น ๆ ว่า GPCR เป็นโปรตีนบนเยื่อหุ้มเซลล์ที่ช่วยให้เซลล์ตอบสนองต่อสัญญาณจากภายนอกเซลล์ สัญญาณเหล่านี้อาจรวมถึงฮอร์โมน สารสื่อประสาท ไขมัน เปปไทด์ รวมถึงแสง

แม้ว่าโครงสร้างเจ็ดชั้นผ่านเยื่อหุ้มของ GPCR จะมีความเหมือนกันอย่างชัดเจน แต่พวกมันไม่ได้ทํางานในลักษณะเดียวกัน ผลลัพธ์ของการทดลองอาจขึ้นอยู่กับลิแกนด์ของตัวรับ สภาพแวดล้อมของเซลล์ ระดับการแสดงออกของตัวรับ และคู่ส่งสัญญาณ

ดังนั้น นักวิจัยจึงต้องก้าวข้ามการวัดการ "กระตุ้น" ตัวรับของสารประกอบเพื่อถอดรหัสชีววิทยาของ GPCR เส้นทางทั้งหมด เวลา รูปแบบการทดสอบ การควบคุม และโมเดลเซลล์ทั้งหมดมีความสําคัญ

ตัวรับโปรตีน G Coupled Receptor: คืออะไร?

จํานวนครั้งที่ GPCR ทั่วไปจะผ่านเยื่อหุ้มเซลล์คือ 7 ครั้ง ส่วนที่อยู่นอกเซลล์จะจับกับโมเลกุลส่งสัญญาณ ส่วนส่วนภายในเซลล์จะจับกับโปรตีน G, arrestins, kinases และโมเลกุลส่งสัญญาณอื่น ๆ

GPCR ถูกจัดประเภทเป็นหลายประเภทหลักตามคู่มือเภสัชวิทยาของ IUPHAR/BPS เช่น ตัวรับระดับ A, ระดับ B, ระดับ C, ตัวรับแบบฟู และตัวรับการยึดเกาะ กลุ่ม A เป็นกลุ่มที่ใหญ่ที่สุด และเกี่ยวข้องกับเป้าหมายที่รู้จักดี เช่น ตัวรับอะดรีเนอร์จิก โดปามีน โอปิออยด์ และตัวรับมัสคารินิก

แม้โครงสร้างจะคล้ายกัน แต่ GPCR สามารถรับรู้สัญญาณที่หลากหลายได้มาก สิ่งนี้ช่วยให้พวกเขามีส่วนร่วมในการรับรู้ทางประสาทสัมผัส การควบคุมหัวใจและหลอดเลือด การเผาผลาญ การทํางานของระบบภูมิคุ้มกัน อารมณ์ การเคลื่อนไหว และอีกมากมาย

GPCR ถูกเปิดใช้งานได้อย่างไร?

ลิแกนด์จะจับกับตัวรับและทําให้ตัวรับเปลี่ยนรูปร่าง จากการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างนี้ ตัวรับจึงสามารถโต้ตอบกับโปรตีนส่งสัญญาณภายในเซลล์ได้

GPCR หลายตัวมีโปรตีน G แบบเฮเทอโรไตรเมียร์เป็นคู่แรกที่ประกอบด้วยหน่วยย่อยอัลฟา เบต้า และแกมมา การกระตุ้นตัวรับจะส่งผลให้ GDP แลกเปลี่ยนกับ GTP ในหน่วยย่อยอัลฟา ส่วนประกอบที่ถูกกระตุ้นจะส่งผลต่อเอนไซม์ ช่องไอออน และสารส่งสารที่สอง

กลุ่มโปรตีน G ที่ได้รับความนิยมมากที่สุด ได้แก่:

• G ซึ่งมักทําให้ AMP แบบหมุนเวียนเพิ่มขึ้น
• ชื่อที่ใช้กันทั่วไปสําหรับเอนไซม์ AMP แบบไซคลิกคือ gi/o
• เส้นทาง Gq/11 ที่ส่งสัญญาณของฟอสโฟลิเปส C และเส้นทางแคลเซียม
• โปรตีนและเซลล์โครงสร้างของตระกูล Rho สามารถควบคุมได้ด้วย G12/13

คําอธิบายในตํารานี้มีประโยชน์ แต่เส้นเป็นสัญญาณที่หายาก! ตัวรับเดียวสามารถส่งสัญญาณผ่านโปรตีน G หลายตัว และการส่งสัญญาณที่เหมาะสมอาจแตกต่างกันไปตามลิแกนด์และชนิดของเซลล์ GPCRdb กล่าวว่าตัวรับสามารถมีปฏิสัมพันธ์กับโปรตีน G, GPCR kinases และ arrestins ซึ่งนําไปสู่การสร้างเส้นทางสัญญาณภายในเซลล์หลากหลายรูปแบบ

บทบาทของผู้ถูกจับ

เมื่อโปรตีน G ถูกกระตุ้นแล้ว การส่งสัญญาณโดย GPCR จะไม่หยุด

ไคเนส GPCR สามารถฟอสโฟรีเลตตัวรับที่ถูกกระตุ้นได้ การหยุดสามารถมีปฏิสัมพันธ์กับตัวรับ ยับยั้งการเชื่อมต่อเพิ่มเติมของตัวรับกับโปรตีน G ส่งเสริมการซึมซับตัวรับ และมีส่วนร่วมในเส้นทางอื่น ๆ ของการส่งสัญญาณ

ดังนั้น การรับสมัคร arrestin จึงไม่สามารถถือเป็น "สวิตช์ปิด" ได้ ขึ้นอยู่กับตัวรับและการทดลอง มันอาจส่งผลต่อการลักลอบ การลดความไว การรีไซเคิล การเสื่อมตัวรับ หรือปรับเปลี่ยนผลกระทบอื่น ๆ ที่ตามมา

เนื่องจากทั้งการส่งสัญญาณโปรตีน G และการเรียกหยุดการหยุดเป็นตัวชี้วัดที่สําคัญของเภสัชวิทยาทั้งหมดของสารประกอบ จึงมักถูกวัดร่วมกัน

บทความในส่วนนี้ศึกษาวิธีที่ตัวรับเดียวกันสามารถนําไปสู่การตอบสนองที่แตกต่างกันได้

GPCR ไม่ใช่แค่สวิตช์เปิด/ปิดเท่านั้น

ลิแกนด์หลายชนิดสามารถจับกับเฟสรูปร่างต่าง ๆ ของตัวรับได้ ลิแกนด์ชนิดหนึ่งสามารถกระตุ้นระดับสูงในเส้นทางโปรตีน G หนึ่ง ในขณะที่อีกเส้นทางหนึ่งอาจทําให้การหยุดนิ่งเพิ่มขึ้นหรือรูปแบบการส่งสัญญาณที่แตกต่างกัน โดยทั่วไปจะเรียกว่าความเลือกปฏิบัติเชิงหน้าที่/สัญญาณที่มีอคติ

พื้นหลังของเซลล์ก็สําคัญเช่นกัน ตัวรับเดียวกันนี้พบได้ในห้องปฏิบัติการสองแห่ง แต่มีปริมาณโปรตีน G ต่างกัน เช่น arrestins, kinases, enzymes หรือตัวรับภายในเซลล์ที่แตกต่างกัน

อีกปัญหาหนึ่งอาจเป็นระดับการแสดงออกของตัวรับ การแสดงออกมากเกินไปสามารถเพิ่มการตอบสนองต่อระดับกิจกรรมต่ําและ/หรือเปลี่ยนความชอบในการจับคู่ และยังอาจทําให้สารกระตุ้นบางส่วนมีฤทธิ์แรงกว่าในเซลล์มากกว่าเนื้อเยื่อธรรมชาติ

ดังนั้นผลลัพธ์จึงควรถูกมองว่าเป็นตัวบ่งชี้พฤติกรรมของระบบทดลองที่สมบูรณ์ ไม่ใช่แค่ตัวรับเท่านั้น

เลือกการทดสอบตามคําถามทางชีววิทยา

ไม่มีการทดสอบ GPCR ตัวใดตัวหนึ่งที่สามารถตอบคําถามทั้งหมดได้

การทดสอบ cAMP

ตัวรับที่มีโปรตีน Gs หรือ Gi มักจะวัดด้วย cAMP การตอบสนองของ Gs อาจนําไปสู่การเพิ่มขึ้นของ cAMP และการตอบสนองของ Gi อาจบ่งชี้โดยการยับยั้งการผลิต cAMP ที่ถูกกระตุ้น

การทดสอบเหล่านี้มักใช้ในการศึกษาการตอบสนองต่อความเข้มข้น การศึกษาลักษณะของสารกระตุ้น และการศึกษาสารต้าน ในการทดลองสารต้านสาร มักจะมีการเติมสารกระตุ้นความเข้มข้นหลังจากที่สารทดสอบสัมผัสกับเซลล์

การทดสอบแคลเซียม

ตัวรับ Gq-coupled อาจถูกศึกษาด้วยการทดสอบแคลเซียมภายในเซลล์ มันสามารถให้ผลการอ่านที่รวดเร็วและรวดเร็ว แต่ระยะเวลาตอบสนองอาจสั้น และขึ้นอยู่กับการจัดการเซลล์ การเติมสี การแสดงออกของตัวรับ และเวลาที่ใช้วัด

การเข้าเล่ม GTPγS

การทดสอบ GTPγS เป็นหนึ่งในเหตุการณ์แรก ๆ ที่ถูกวัดในกระบวนการกระตุ้นโปรตีน G และมักใช้เพื่อยืนยันกิจกรรมของตัวกระตุ้นในผลิตภัณฑ์เยื่อหุ้มเซลล์ เนื่องจากการทดสอบนี้อยู่ใกล้กับปฏิสัมพันธ์ระหว่างตัวรับกับโปรตีน G จึงช่วยลดการขยายสัญญาณบางส่วนที่เกิดขึ้นในผลลัพธ์ด้านล่าง

การรับสมัครนักจับกุม

การทดสอบ arrestin สามารถใช้ศึกษาความลําเอียงของเส้นทาง สัญญาณเฉพาะลิแกนด์ การขนส่งตัวรับ และการลดความไวของตัวรับ ควรใช้ร่วมกับการทดสอบโปรตีน G มากกว่าการใช้เป็นตัวบ่งชี้ทั่วไปของการกระตุ้นตัวรับ

เซ็นเซอร์ชีวภาพเซลล์สด

เทคนิค BRET และ FRET (รวมถึงวิธีไบโอเซนเซอร์อื่น ๆ) สามารถติดตามเหตุการณ์สัญญาณในเซลล์มีชีวิตได้ตามเวลา จุดขายที่ใหญ่ที่สุดของที่นั่นคือข้อมูลจลน์: นักวิจัยสามารถวัดได้ว่าสัญญาณเริ่มต้นเมื่อไหร่ เมื่อมันถึงจุดสูงสุดหรือลดลง เพราะพวกเขาวัดได้มากกว่าหนึ่งจุดปลายทาง

ทําการทดลอง GPCR ที่แม่นยํา

การทดสอบที่ดีควรอิงจากชีวภาพ ไม่ใช่เครื่องมือ

อันดับแรก ให้แน่ใจว่าตัวรับแสดงออกและอยู่ในตําแหน่งที่ถูกต้องบนเยื่อหุ้มเซลล์ การตอบสนองต่ําอาจไม่ได้เกิดจากกิจกรรมของลิแกนด์ต่ํา แต่เป็นผลมาจากการแสดงออกหรือการส่งตัวรับที่ไม่ดี

ประการที่สอง เพิ่มอุปกรณ์ควบคุมที่เหมาะสม โดยทั่วไป อาจต้องใช้สารกระตุ้นที่รู้จัก สารต้านที่รู้จัก ตัวควบคุมยานพาหนะ เซลล์ที่ไม่ได้ถ่ายโอนสาร และตัวควบคุมที่ไม่ขึ้นกับตัวรับสําหรับการทดสอบในขั้นตอนถัดไป

สุดท้าย ให้ทํากราฟความเข้มข้น-การตอบสนองอย่างสมบูรณ์ การประเมินเพียงความเข้มข้นเดียวของสารประกอบจะไม่สามารถวัดความแรง ประสิทธิผล การป้องกันบางส่วน ความเป็นพิษ หรือการรบกวนที่ไม่เฉพาะเจาะจงต่อการทดสอบได้อย่างน่าเชื่อถือ

จําเป็นต้องมีการกําหนดเวลาให้เป็นมาตรฐานเดียวกัน เมื่อคุณได้รับสัญญาณแคลเซียมภายในไม่กี่วินาที และอีกไม่กี่ชั่วโมงต่อมาคุณวัดการแสดงออกของยีน คุณไม่สามารถเปรียบเทียบสองสิ่งนี้ได้โดยตรง การทดสอบที่วัดตัวรับเดียวกันสามารถใช้วัดเฟสต่าง ๆ ของการตอบสนองได้

สุดท้าย ตรวจสอบผลลัพธ์ที่สําคัญโดยใช้วิธีออร์โธโกนัล หากพบว่าสารประกอบใดมีฤทธิ์ในการทดสอบ cAMP ควรยืนยันด้วยการทดสอบที่มีประโยชน์อื่น เช่น การทดสอบจับ หรือด้วยตัวควบคุมบวกเฉพาะตัวรับ คู่มือแนวทางการทดสอบแนะนําว่าควรมีการตรวจสอบความถูกต้องอย่างรอบคอบ การควบคุมคุณภาพ และการวิเคราะห์ลักษณะทางเภสัชวิทยาของผลลัพธ์ GPCR เพื่อมุ่งสู่การเพิ่มประสิทธิภาพลีด

GPCR สําหรับการค้นพบยา

GPCR ยังคงมีบทบาทสําคัญในการค้นคว้ายา เนื่องจากมีส่วนเกี่ยวข้องกับหลายด้านของสรีรวิทยาและแสดงออกบนผิวเซลล์ GPCRdb ประเมินว่า 25% ของฮอร์โมนมนุษย์เกี่ยวข้องกับสมาชิกในตระกูลตัวรับนี้ และประมาณ 1 ใน 3 ของยาทั้งหมดมุ่งเป้าไปที่สมาชิกในตระกูลตัวรับนี้

สําหรับโปรแกรมแบบดั้งเดิม เป้าหมายการค้นหาหลักจะเป็นตัวกระตุ้นหรือตัวต้านที่จับกับตําแหน่งจับลิแกนด์หลัก การศึกษาตัวปรับอัลโลสเตอริก ลิแกนด์ที่มีอคติตามเส้นทาง ความเลือกเฉพาะของตัวรับ-ทรานสดิวเซอร์ จลนพลศาสตร์การจับ และการออกแบบสารประกอบตามโครงสร้าง ก็อยู่ระหว่างการศึกษาเช่นกัน

ด้วยการมาถึงของชีววิทยาโครงสร้าง สิ่งนี้จึงเป็นไปได้มากขึ้น GPCRdb ปัจจุบันมีเครื่องมือเปรียบเทียบตําแหน่งจับและสถานะการกระตุ้นของ GPCRs รวมถึงโครงสร้างตัวรับที่ตรวจวัดโดยการทดลอง คอมเพล็กซ์ตัวรับ–ลิแกนด์ และคอมเพล็กซ์โปรตีนรีเซปเตอร์–G

สารประกอบที่มีโครงสร้างดีควรได้รับการทดสอบการทํางานแม้จะมีโครงสร้างที่ดี โมเลกุลสามารถจับกับเป้าหมายที่เหมาะสมด้วยความสามารถในการจับที่แข็งแกร่งแต่ไม่กระตุ้นการตอบสนองของเซลล์ตามที่ต้องการ หรือในทางกลับกัน โมเลกุลอาจจับกับเส้นทางที่ต้องการแต่ไม่ถูกต้อง

บทสรุป

ตัวรับที่เชื่อมโยงโปรตีน G ควรถูกมองว่าไม่ใช่แค่สวิตช์เยื่อหุ้ม แต่เป็นระบบส่งสัญญาณที่ยืดหยุ่น

ตัวรับจะเปลี่ยนรูปร่างเมื่อเกิดการจับกับลิแกนด์ ตัวรับจะหาคู่ในเซลล์ และสภาพแวดล้อมของเซลล์จะเป็นตัวกําหนดทิศทางของสัญญาณ ดังนั้นจึงสําคัญที่จะต้องพิจารณาการเลือกการทดสอบ การแสดงออกของตัวรับ ช่วงเวลาของเส้นทาง การควบคุม และการตรวจสอบแบบออร์โธโกนัล

ข้อสรุปที่ดีที่สุดสําหรับการวิจัยและการค้นพบยาของ GPCR มักเกิดจากการผสมผสานข้อมูลโครงสร้างและการทดสอบเชิงหน้าที่มากกว่าหนึ่งครั้ง

คําถามที่พบบ่อย

คําถามที่ 1. หน้าที่หลักของ GPCR คืออะไร?

GPCR คือตัวรับบนผิวเซลล์ที่ตอบสนองต่อสัญญาณภายนอกเซลล์และสร้างการตอบสนองภายในเซลล์ คําตอบอาจมาจากโปรตีน G, arrestins, สารส่งสารที่สอง, ช่องไอออน หรือการควบคุมยีน

คําถามที่ 2 GPCR ทั้งหมดถูกกระตุ้นโดยโปรตีน G ชนิดเดียวกันหรือไม่?

ไม่ ตัวรับหลายชนิดสามารถเลือกกระตุ้นโปรตีน G ต่าง ๆ (Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13 หรือคู่ส่งสัญญาณหลายตัว)

คําถามที่ 3. Orphan GPCR คืออะไร?

Orphan GPCR คือตัวรับที่ยังไม่แน่นอนว่าลิแกนด์ที่กระตุ้นตามธรรมชาติคืออะไร ตัวรับเหล่านี้ยังคงมีความสําคัญอย่างมากต่อการวิจัยพื้นฐานและการพัฒนายา

คําถามที่ 4 แล้วควรใช้การทดสอบแบบไหนสําหรับการคัดกรอง GPCR?

การทดสอบที่ "ดีที่สุด" จะขึ้นอยู่กับคําถามที่ต้องการตอบและเส้นทางสัญญาณของตัวรับ แง่มุมต่าง ๆ ของการตอบสนองสามารถวัดได้โดยใช้ cAMP, แคลเซียม, GTPγS, การหยุด และการทดสอบเซ็นเซอร์ชีวภาพเซลล์มีชีวิต

คําถามที่ 5 เหตุผลที่นักวิจัยใช้การทดสอบมากกว่าหนึ่งวิธีคืออะไร?

การทดสอบหนึ่งครั้งสามารถวัดได้เพียงเส้นทางเดียวหรือมีการรบกวนเฉพาะรูปแบบ หากสามารถแสดงให้เห็นด้วยการทดสอบแบบตั้งฉากว่าผลที่สังเกตได้เกี่ยวข้องกับตัวรับจริง ก็สามารถสรุปได้ว่านี่เป็นผลของตัวรับจริง