ชุดฟลูออโรมิเตอร์: คู่มือปฏิบัติสําหรับการวัดปริมาณตัวอย่างที่ไวต่อความรู้สึก

ในห้องปฏิบัติการชีววิทยาระดับโมเลกุล สามารถวัดดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอ หรือโปรตีนได้โดยใช้ชุดฟลูออโรมิเตอร์ที่ใช้ฟลูออเรสเซนซ์ การทดสอบเหล่านี้อิงกับสีย้อมที่มีสัญญาณสูงกว่าเมื่อจับกับเป้าหมายเฉพาะ แทนที่จะวัดการดูดกลืนรังสียูวีโดยรวม ความเลือกสรรนี้เป็นประโยชน์หากตัวอย่างเจือจาง มีปริมาตรน้อย หรือปนเปื้อนสารอื่นที่อาจรบกวนการวัดการดูดกลืน

กระบวนการทํางานเต็มรูปแบบโดยทั่วไปประกอบด้วยสารทดสอบ บัฟเฟอร์เจือจาง มาตรฐาน หลอดทดสอบหรือแผ่นทดสอบ และฟลูออโรมิเตอร์ที่เหมาะสมกับกระบวนการ ช่วงของการทดสอบมีความสําคัญต่อการได้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้ รวมถึงความสม่ําเสมอของการเตรียมมาตรฐาน การป้องกันการสัมผัสแสงที่ไม่เหมาะสมของสารตั้งต้น และการบันทึกการเจือจางทั้งหมดอย่างแม่นยํา

ชุดฟลูออโรมิเตอร์ประกอบด้วยวัสดุและอุปกรณ์ทั้งหมดที่จําเป็นสําหรับการวัดฟลูออเรสเซนซ์

ชุดทดสอบฟลูออโรมิเตอร์ส่วนใหญ่ประกอบด้วยสีย้อมเรืองแสงเข้มข้นสูง บัฟเฟอร์การทดสอบ และมาตรฐานอ้างอิง หลอด การ์ดโปรโตคอล หรือการตั้งค่าการทดสอบเฉพาะเครื่องมือก็มีอยู่ในชุดอุปกรณ์บางชุดด้วย

เคมีของสีย้อมจะเป็นปัจจัยกําหนดว่าการทดสอบจะวัดอะไร การวัดปริมาณ dsDNA แบบเลือกปฏิบัติควรทําบนชุดดีเอ็นเอสายคู่ การทดสอบ RNA, DNA สายเดี่ยว และโปรตีน มีพื้นฐานจากเคมีการจับที่แตกต่างกันและไม่สามารถใช้แทนกันได้

ตัวอย่างหนึ่งคือชุดทดสอบ dsDNA เชิงพาณิชย์อาจประกอบด้วยสารทดสอบเข้มข้น บัฟเฟอร์เจือจาง และมาตรฐานดีเอ็นเอเจือจางล่วงหน้า มีระบบอื่น ๆ ที่สามารถจ่ายสารเคมีที่เข้ากันได้กับฟลูออโรมิเตอร์แบบหลอดเดี่ยวหรือไมโครเพลต โดยมีความยาวคลื่นการกระตุ้นและการปล่อยแสงที่เหมาะสม

บางครั้ง การเรืองแสงดีกว่าการดูดกลืนรังสียูวี

การประมาณความเข้มข้นของกรดนิวคลีอิกด้วยสเปกโตรโฟโตเมตรีด้วยรังสียูวีอิงจากการดูดกลืนที่ 260 นาโนเมตร มันรวดเร็วและมีประโยชน์สําหรับอัตราส่วนความบริสุทธิ์ แต่เกลือ นิวคลีโอไทด์อิสระ โปรตีน RNA DNA และสารอินทรีย์อื่น ๆ สามารถทําให้เกิดสัญญาณการดูดกลืนได้

การทดสอบเรืองแสงถูกออกแบบมาเพื่อให้เฉพาะเจาะจงกับสารวิเคราะห์ที่เลือกไว้ สิ่งนี้จะช่วยเพิ่มความแม่นยําของตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ําหรือตัวอย่างที่อาจมีสารมลพิษ ดังนั้นการวัดปริมาณด้วยฟลูออโรเมตริกจึงมีความไวและเลือกเฉพาะมากกว่าการดูดกลืนรังสียูวีสําหรับการวัดดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอ หรือโปรตีนเฉพาะ

ทั้งสองวิธีสามารถใช้ร่วมกันได้ ฟลูออเรสเซนซ์สามารถใช้วัดความเข้มข้นของเป้าหมายที่กําหนด และการดูดกลืนรังสียูวีสามารถให้การวัดความบริสุทธิ์ที่กว้างขึ้น

เลือกชุดสําหรับช่วงสารวิเคราะห์และการวัด

มีชุดฟลูออโรมิเตอร์ที่ใช้กันทั่วไปหลายประเภท เช่น:

• การทดสอบ dsDNA ที่มีความไวสูง
• การทดสอบ dsDNA ในวงกว้าง
• การทดสอบ RNA
• การทดสอบ ssDNA
• การทดสอบโปรตีน
• การทดสอบคุณภาพ RNA

สารสกัดที่มีความเข้มข้นต่ําและคลังการจัดลําดับที่เตรียมไว้สามารถตรวจพบได้ด้วยการทดสอบความไวสูง การทดสอบช่วงแคบเหมาะกับตัวอย่างที่มีความเข้มข้นสูง ตัวอย่างที่อยู่นอกช่วงที่ได้รับการยืนยันจะต้องเจือจาง มิฉะนั้นผลลัพธ์อาจไม่น่าเชื่อถือ

ช่วงการคํานวณระหว่างชุดตรวจที่มีความไวสูงและชุดวัดกว้างอาจแตกต่างกันและใช้สารวิเคราะห์ชนิดเดียวกัน ดังนั้น การคัดเลือกควรเลือกโดยอิงจากความเข้มข้นที่คาดไว้ ไม่ใช่แค่ชื่อตัวอย่างเท่านั้น

ชุดนี้ต้องเข้ากันได้กับฟลูออโรมิเตอร์ด้วย ตรวจสอบช่องทางการกระตุ้นและการปล่อย รูปแบบหลอด/แผ่น ปริมาตรตัวอย่าง วิธีการสอบเทียบ และตัวเลือกการทดสอบที่ตั้งโปรแกรมไว้ โปรโตคอลเฉพาะสามารถตั้งโปรแกรมล่วงหน้าในฟลูออโรมิเตอร์บางรุ่นสําหรับการวิเคราะห์ dsDNA, RNA และ ssDNA ส่วนบางโปรโตคอลสามารถตั้งโปรแกรมเฉพาะได้

เขียนคํานิยามสําหรับปริมาณตัวอย่างและปริมาณการผลิต

ปริมาณน้อยมีประโยชน์หากตัวอย่างหายาก หรือต้องการการเก็บรักษาเพื่อการทดลองในขั้นตอนถัดไป ในระบบฟลูออโรเมตริกแบบตั้งโต๊ะบางระบบต้องการตัวอย่างไม่กี่ไมโครลิตร แต่โดยทั่วไปตัวอย่างจะถูกใส่ลงในสารละลายที่มีปริมาณมากขึ้น

ปริมาณการผลิตก็เป็นปัจจัยสําคัญเช่นกัน สําหรับการวัดเป็นครั้งคราวและการผลิตในชุดเล็ก ๆ อาจเหมาะสมกับฟลูออโรมิเตอร์หลอดเดียว เครื่องมือหรือเวิร์กโฟลว์ไมโครเพลตที่สามารถประมวลผลตัวอย่างสกัดหลายตัวหรือไลบรารีลําดับหลายชุด อาจเหมาะสมสําหรับห้องปฏิบัติการที่มีตัวอย่างจํานวนมาก

ไม่ใช่ทุกเครื่องดนตรีจะใช้งานได้จริงที่สุด ระบบที่ดีควรลดการดูดซ้ํา ๆ ให้ง่ายขึ้น เตรียมตัวอย่างตามปกติ และให้ตรงกับจํานวนตัวอย่างที่ห้องปฏิบัติการจะจัดการเป็นประจํา

เพื่อปฏิบัติตามเวิร์กโฟลว์การทดสอบที่สอดคล้องกัน

ต่อไปนี้คือมาตรฐานของชุดฟลูออโรมิเตอร์:

• A. โซลูชันที่ใช้งานได้ถูกเตรียมไว้แล้ว จึงมีทางออกที่ใช้งานได้จริง
• การกําหนดมาตรฐานที่จําเป็น
• การเพิ่มตัวอย่างที่ไม่รู้จักแต่ละตัว
• การผสมผสานตัวอย่างและมาตรฐานอย่างละเอียด
• การฟักตัวตามระยะเวลาที่กําหนด
• ป้องกันปฏิกิริยาจากการได้รับแสงที่ไม่เหมาะสม
• ใช้ไม้บรรทัดวัดความกว้างและความยาวของสมอง การวัดสมองอย่างถูกต้องโดยใช้ไม้บรรทัด
• การใช้ปัจจัยเจือจางของตัวอย่าง

ใช้ปิเปตที่ผ่านการปรับเทียบเพื่อเตรียมและใช้มาตรฐานและตัวอย่างในลักษณะเดียวกัน หากขั้นตอนการดูดเลือดทําด้วยปริมาตรต่ํา ความผิดพลาดเล็กน้อยในปริมาตรสามารถสร้างความแตกต่างอย่างมากในความเข้มข้นสุดท้าย

ระยะเวลาที่ใช้ในการฟักไข่ก็สําคัญเช่นกัน การเก็บตัวอย่างหนึ่งในช่วงเริ่มต้น และอีกตัวอย่างหนึ่งในภายหลัง อาจทําให้เกิดความแตกต่างที่ไม่จําเป็น การทดสอบบางชนิดยังไวต่อความแตกต่างของอุณหภูมิระหว่างมาตรฐานกับตัวอย่าง

ใช้มาตรฐาน ช่องว่าง และการทําซ้ําอย่างเหมาะสม

มาตรฐานถูกใช้เพื่อเชื่อมโยงปริมาณสารวิเคราะห์กับความเข้มของเรืองแสง ควรผสมให้ทั่ว ติดฉลากอย่างถูกต้อง และหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน

เมื่อมีการใส่ตัวอย่างที่ไม่ทราบชนิดลงในช่องว่าง สัญญาณที่วัดได้จะเกิดจากสารตั้งต้น บัฟเฟอร์ หลอด หรือเมทริกซ์ตัวอย่างพื้นหลัง การวัดซ้ํามีประโยชน์หากตัวอย่างมีคุณค่า ความเข้มข้นที่แน่นอนใกล้เคียงกับขีดจํากัดการทดสอบ หรือผลลัพธ์ที่ไม่คาดคิดจะส่งผลกระทบต่อกระบวนการปลายน้ําที่มีค่าใช้จ่ายสูง

หากมีการอ่านซ้ําที่ไม่ตรงกัน อย่าคํานวณค่าเฉลี่ยของทั้งสองค่าเพียงอย่างเดียว ตรวจสอบความแม่นยําในการดูดจ่าย การผสมตัวอย่าง การมีฟองอากาศ ความสะอาดของท่อ ระยะเวลาการบ่ม อุณหภูมิ และช่วงการวัดที่เลือก

ผู้ชายและผู้หญิงมีวิธีวัดความเจ็บปวดที่แตกต่างกัน

สาเหตุทั่วไปบางประการที่ทําให้ผลฟลูออโรเมตรีไม่น่าเชื่อถือ ได้แก่:

• การเลือกการทดสอบที่ไม่ถูกต้องสําหรับเป้าหมาย
• การเลือกช่วงความไวที่ไม่เหมาะสม
• ไม่ใช้ภาชนะที่เหมาะสมสําหรับการเก็บรักษาและเตรียม
• การเพิ่มปริมาตรตัวอย่างที่ไม่สอดคล้องกัน
• การมีอยู่ของสารปนเปื้อนในมาตรฐานหรือสารละลายที่ใช้งานได้
• กับดักสําหรับทิ้งฟองอากาศในเส้นทางแสง
• ห้ามใช้ท่อที่มีรอยขีดข่วนหรือไม่เข้ากัน ไม่อนุญาตให้ใช้ท่อที่มีรอยขีดข่วนหรือไม่เข้ากันได้
• การสัมผัสกับสารรีเอเจนต์ที่ไวต่อแสงมากเกินไป
• อย่าคิดว่าจํานวนเซลล์ในตัวอย่างจะลดลงจากการเจือจาง
• การใช้อุปกรณ์นอกช่วงของอุปกรณ์ที่ได้รับการตรวจสอบ

ตัวอย่างที่มีความเข้มข้นยังสามารถปนเปื้อนปิเปตหรือพื้นที่ทํางาน และส่งผลกระทบต่อตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ําในอนาคต ปัญหานี้ลดลงด้วยการใช้หัวทิปใหม่ พื้นผิวทํางานที่สะอาด และลําดับตัวอย่างที่มีเหตุผล

เชื่อมต่อการวัดกับเวิร์กโฟลว์ Downstream โดยลากไปยังเวิร์กโฟลว์ Downstream

ชุดฟลูออโรมิเตอร์มักถูกนํามาใช้ก่อน PCR, qPCR, การโคลนนิ่ง, การเตรียมห้องสมุดลําดับ, อิเล็กโทรโฟรีซิส, การถ่ายโอน และกระบวนการอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับการป้อนตัวอย่างอย่างควบคุม

การควอนไทเมนต์มีความสําคัญเพื่อปรับมาตรฐานตัวอย่าง เปรียบเทียบผลผลิตจากการสกัด และให้ข้อมูลปฏิกิริยาที่สม่ําเสมอ การทดสอบ RNA (แบบเรืองแสง) จะถูกนําไปใช้ล่วงหน้าก่อนการใช้งานอื่น ๆ เช่น RT-PCR และการเตรียม cDNA ห้องสมุด; การวัดปริมาณดีเอ็นเอถูกนําไปใช้ในแอปพลิเคชันต่าง ๆ เช่น PCR, การโคลนนิ่ง, การถ่ายโอน และการถอดรหัสรุ่นถัดไป

ดังนั้นการเลือกชุดอุปกรณ์จึงควรสอดคล้องกับการตัดสินใจหลังจากการวัด สามารถใช้การทดสอบช่วงกว้างในการตรวจสอบการสกัดตามปกติ และการทดสอบที่มีความไวมากขึ้นสําหรับงานลําดับอินพุตต่ํา

ดูแลและจัดการสารตั้งต้นอย่างเหมาะสมเสมอ

สารรีเอเจนต์เรืองแสงอาจไวต่อแสง อุณหภูมิ และการจัดการ เก็บรักษา อุ่น ผสม และหมดอายุตามคําแนะนําของชุด ไม่ใช่สีย้อมเรืองแสงทุกชนิดที่จะสามารถแช่แข็ง เก็บรักษาที่อุณหภูมิห้อง หรือสัมผัสกับแสงในห้องปฏิบัติการได้

ทําเครื่องหมายโซลูชันที่ใช้งานได้อย่างชัดเจนและอย่าลืมบันทึกวันที่ที่ผลิต ก่อนที่จะสงสัยว่าตัวอย่างต้นฉบับเปลี่ยนแปลง ให้ตรวจสอบอายุของสารตั้งต้น ประวัติการเก็บรักษาสารตั้งต้น มาตรฐาน ปิเปต การตั้งค่าเครื่องมือ อุณหภูมิ และความเข้ากันได้ของหลอด

บทสรุป

ชุดฟลูออโรมิเตอร์มีความไวและคัดเลือกเฉพาะในการตรวจจับปริมาณดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอ หรือโปรตีน โดยเฉพาะในตัวอย่างที่มีค่าหรือเจือจาง การวัดที่เชื่อถือได้ต้องการให้การทดสอบเหมาะสมกับช่วงสารวิเคราะห์และความเข้มข้น การใช้ฟลูออโรมิเตอร์ที่เหมาะสม การเตรียมมาตรฐานอย่างสม่ําเสมอ และการควบคุมกระบวนการทั้งหมด

ไม่ใช่ชุดที่มีขีดจํากัดการตรวจจับต่ําสุดที่ระบุว่าเป็นชุดที่ดีที่สุด เป็นอุปกรณ์ที่ตรงกับประเภทตัวอย่าง ปริมาณการผลิต การใช้งานในขั้นตอนถัดไป และข้อกําหนดการควบคุมคุณภาพของห้องปฏิบัติการ

คําถามที่พบบ่อย

คําถามที่ 1. ชุดฟลูออโรมิเตอร์มีการใช้งานอย่างไรบ้าง?

มีชุดทดสอบหลายแบบสําหรับการทดสอบคุณภาพ dsDNA, ssDNA, RNA และบางประเภท เคมีของวิธีการคัดกรองควรเหมาะสมกับเป้าหมาย

คําถามที่ 2 ชุดฟลูออโรมิเตอร์หรือวิธี UV แบบไหนมีประสิทธิภาพมากกว่ากัน?

พวกเขามักจะมีความเฉพาะเจาะจงและไวต่อสารวิเคราะห์ชนิดใดชนิดหนึ่งมากกว่า การดูดกลืนรังสียูวียังคงถือว่าใช้ได้สําหรับการทดสอบความบริสุทธิ์แบบกึ่งสุดท้ายและการวัดความบริสุทธิ์โดยรวมของตัวอย่าง

คําถามที่ 3. คุณต้องการตัวอย่างเท่าไหร่?

ปริมาณจะแตกต่างกันไปตามการทดสอบและเครื่องมือต่าง ๆ! จริง ๆ แล้ว มีระบบบนโต๊ะทํางานมากมายที่ใช้เพียงไม่กี่ไมโครลิตรของตัวอย่างต้นฉบับ

คําถามที่ 4 สารรีเอเจนต์ที่ใช้ในการทดสอบ DNA RNA คืออะไร?

โดยปกติจะไม่เลือกเฉพาะเจาะจง ในการใช้งานทั่วไป อาจต้องการวัดปริมาณดีเอ็นเอและ/หรือ RNA ดังนั้น การทดสอบอาจเฉพาะเจาะจงสําหรับหนึ่งต่อหนึ่งหรือทั้งสอง

คําถามที่ 5 อะไรคือสาเหตุของความแตกต่างในผลลัพธ์จากการจําลองที่แตกต่างกัน?

สิ่งเหล่านี้มักเกิดจากข้อผิดพลาดในการดูดน้ํา การผสมที่ไม่เหมาะสม ฟองอากาศ การปนเปื้อน อุณหภูมิ หรือช่วงความผิดพลาดของการวัด